HPLC法测定果蔬纤维颗粒中荷叶碱含量

田 垚，王 莲，李 征，罗 威，张荣泉

(天津市医药科学研究所，天津 300020)

果蔬纤维颗粒由荷叶、决明子、果蔬纤维、南瓜粉等组方，经制粒等工艺制备而成，具有降脂、通便、调节血糖和预防食物摄入过量等作用[1]。《本草纲目》记载荷叶能解毒敛疮，可降脂、清热、静心益色、驻颜轻身[2]。荷叶中含有荷叶碱、黄酮、挥发油、有机酸、皂苷及甾体等多种化学成分，其主要活性物质荷叶碱是一种阿朴啡型生物碱，现代药理学研究认为荷叶碱有促进脂肪分解，降低血清中甘油三醇和胆固醇含量，及调节血脂等作用，还具有利尿通便、通肠毒、清暑解热等作用[3]。本品以荷叶碱作为有效成分，拟建立果蔬纤维颗粒中荷叶碱的高效液相色谱检测方法，以保证该产品的质量稳定。

1 仪器与试药

1.1仪器 高效液相色谱仪(日本岛津公司)，KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LDZ5-2离心机(最高转速：5 000 r/min，北京京立离心机有限公司)；AB204-E型电子天平(万分之一精度)。

1.2试药 荷叶碱对照品(四川省维克奇生物科技有限公司提供，批号201009)；果蔬纤维颗粒(天津市医药研究开发公司)；无水乙醇，三乙胺，冰醋酸均为分析纯；乙腈为色谱纯，实验用水为纯化水。

2 方法和结果

2.1色谱条件[4]色谱柱：依利特Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)；流动相：乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(34∶63.6∶1.6∶0.78)；流速：1.0 ml/min；检测波长：270 nm；进样量：20 μl；柱温：30 ℃。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取荷叶碱对照品14.7 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，混匀，即得荷叶碱对照品储备液A(294 μg /ml)。再精密吸取对照品储备液A 1.0 ml置25 ml量瓶内，用甲醇定容，制成对照品储备液B(11.76 μg /ml)。 精密吸取对照品储备液B 3.0 ml置10 ml量瓶内，用甲醇定容，制成对照品溶液(3.528 μg /ml)。

2.2.2供试品溶液的制备 取果蔬纤维颗粒供试品适量，研细，精密称取约2.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，称定重量，超声处理60 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀。将超声后的供试品离心处理(2 500 r/min)5 min，精密吸取上层清液20 ml，置蒸发皿中蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定容置5 ml量瓶中，即得供试品溶液。

2.2.3阴性样品溶液的制备 按照果蔬纤维颗粒配方，去除含有荷叶碱成分的荷叶药材，以辅料补齐重量，相同工艺制成样品，做为阴性样品并按“2.2.2”项下制成阴性样品溶液。

2.3干扰试验 取对照品溶液，供试品溶液及阴性样品溶液分别进样，进行HPLC测定。结果显示供试品溶液色谱图与对照品溶液色谱图中的相同位置(约13 min处)，有相同的色谱峰出现，而阴性样品溶液在此处无峰(图1)。由此表明处方中其他成分对荷叶碱含量测定无干扰。

2.4线性关系考查 精密吸取对照品溶液B 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml置于10 ml量瓶中，加入甲醇至刻度。将以上6个浓度的对照品溶液分别注入液相色谱仪中测定，以溶液浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程为Y=75 046X+105.21(r=0.999 8)。结果表明荷叶碱进样浓度在0.588～5.88 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。

1.荷叶碱图1 阴性样品(A)对照品(B)供试品(C)HPLC色谱图

2.5精密度试验 将对照品溶液连续进样6次，进行HPLC测定。测定结果峰面积值的RSD为0.58%(n=6)。

2.6重现性试验 精密称取同一批供试品6份，依法制备供试品溶液并测定。测定结果荷叶碱含量的RSD为0.71%(n=6)。

2.7稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、1、2、4、6、8和24 h时进样测定。测定结果峰面积的RSD为0.83%(n=7)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8加样回收试验 精密称取荷叶碱含量为14.482 μg/g的供试品约1.5 g，共9份，分别精密加入稀释100倍的对照品储备液A 2.5、5.0、7.5 ml(相当荷叶碱7.35、14.70、22.05 μg)各3份，依法提取，再分别注入液相色谱仪中进行测定，计算回收率。9份测定结果平均回收率为98.56%，RSD为1.13%(n=9)，荷叶碱加样回收试验结果见表1。

2.9样品含量测定 取果蔬纤维颗粒3批产品为供试品(批号分别为20100911、20100925、20101009)，按照拟定的溶液制备方法和高效液相色谱条件测定果蔬纤维颗粒中荷叶碱的含量。3批供试品中荷叶碱含量测定结果分别为15.580、14.602和15.223 μg/g。

表1 荷叶碱加样回收试验结果

3 讨论

3.1测定波长的选择 荷叶碱对照品溶液，以试剂为空白，用紫外分光光度仪选择波长，在190～700 nm范围内扫描，荷叶碱在270 nm处有最大吸收，故选择270 nm波长为荷叶碱测定波长。

3.2供试品荷叶碱提取方法的选择 在对供试品处理时，考查了以不同浓度的甲醇(50%甲醇、70%甲醇、无水甲醇)做为提取溶剂提取荷叶碱的效果，试验结果表明使用50%甲醇提取时，供试品中荷叶碱的提取率较高。提取超声时间选择试验中，分别考查了超声30、45、60和90 min；测定结果显示，供试品在超声提取60 min后，荷叶碱提取率达可达90%以上，与超声90 min时的荷叶碱含量无显著性差异，因此可选择超声60 min。

3.3果蔬纤维颗粒在制备过程中，因加入了部分原料粉末，配方中黏合剂的使用对超声提取效果有一定的影响，用常规方法处理样品，因过滤困难使回收率受到影响，本试验中采用了离心方法，在设定的离心条件下处理样品，定量吸取上清液，经定量转移、浓缩等可获得满意结果。

1 张荣泉，吕方，王莲.比色法测定果蔬纤维颗粒中总黄酮的含量.食品研究与开发，2008,29(10)：95

2 孔文琦，李严巍.荷叶活性化学成分及药理研究进展.中药研究与信息，2005，7(6)：22

3 朱秀萍，徐翔.荷叶生物碱研究进展.中国药房，2008，19(6)：459

4 柴金玲，李伟，谷学新.高效液相色谱法测定荷叶中荷叶碱的含量.药物分析杂志，2005，25(8)：932