五种抗生素联合应用对大肠杆菌抗菌效果实验

杜冬冬，王 涛，常维山

(山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018)

药物滥用导致大肠杆菌等细菌的耐药性是影响畜牧业健康发展的主要原因，如何减少细菌耐药性，已经成为人们越来越关心的话题。着眼于目前养殖行业的实际情况，新兽药的研发和合理用药是解决目前问题的关键，但是兽药研发周期长，合理用药是目前最适合的方法。两种或两种以上抗生素药物配伍时，可发生两种截然不同的效果。作用相加或协同，疗效增强对治疗大有裨益，临床宜多用;作用拮抗，疗效降低或毒性增强，对治疗颇为有害，临床禁用［1］。试验选取的亚胺培南、头孢曲松钠、头孢噻肟钠均属于β－内酰胺类，其作用机理为抑制细菌细胞壁的合成，是繁殖期杀菌剂［2］;阿米卡星，又名丁胺卡那霉素，是半合成的氨基糖苷类抗生素，其作用机理是抑制细菌蛋白质的合成［2］;痢菌净，又名乙酰甲喹，其作用机制是抑制细菌的DNA合成［2］。亚胺培南抗菌谱最广，抗菌作用最强，是对β－内酰胺酶高度稳定的一种β－内酰胺类抗生素［3］，本试验旨在研究亚胺培南与头孢曲松钠、亚胺培南与头孢噻肟钠联用后对大肠杆菌的抗菌活性及联合效果，从而为临床用药提供指导［4－5］。痢菌净为临床常用药，但其治疗剂量接近中毒剂量，临床应用易中毒。研究丁胺卡那与痢菌净联合应用对大肠杆菌的抑菌效果，从而确定两种药物联用是否可以降低痢菌净的用量。通过联合用药以减少细菌耐药性和药物用量，具有实际应用价值。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 抗菌药物 亚胺培南(含量 50%，批号10007)，韩国中外制药株式会社;头孢曲松钠(含量98%，批号100723)，上海新亚药业有限公司;痢菌净(含量98.5%，批号060509)，成都华康动物药业有限公司;头孢噻肟钠(含量 97.5%，批号100201)，上海新先锋药业有限公司;丁胺卡那(含量96%，批号100716)，上海新亚药业有限公司。

1.1.2 试验菌株 大肠杆菌(ATCC25922)，南京便诊生物科技有限公司。

1.1.3 培养基 Muller－Hinton(MH)肉汤和Muller－Hinton(MH)琼脂培养基，美国Difco公司产品。

1.2 方法

1.2.1 稀释药物 无菌精确称取亚胺培南、头孢曲松钠、头孢噻肟钠、丁胺卡那、痢菌净，用无菌蒸馏水溶解并稀释成2048 μg/mL的溶液，于－20℃保存［6］。

1.2.2 菌悬液的制备 从过夜培养的琼脂培养基平板上挑取3个菌落，接种于MH肉汤中增菌6 h。以平板计数法进行细菌计数后，用MH肉汤稀释1.5 ×105CFU/mL［7］。

1.2.3 最小抑菌浓度的测定(MIC)参照微量肉汤稀释法测定各抗生素单用的最小抑菌浓度(MIC)。将亚胺培南、头孢曲松钠、头孢噻肟钠、丁胺卡那、痢菌净等5种抗菌药物以灭菌MH肉汤倍比稀释成 23个浓度，分别为 2048、1024……0.0005 μg/mL，分别取 100 μL 依次加入 96 孔板，再将 1.5×105CFU/mL菌液 100 μL加入孔中，37℃过夜培养，观察结果，以无菌生长的最低浓度为该药单用最小抑菌浓度 MIC［8－10］。

1.2.4 亚胺培南与头孢曲松钠药物联合应用对大肠杆菌ATCC25922的FIC指数测定 将亚胺培南和头孢曲松钠分别用灭菌MH肉汤倍比稀释，按棋盘法设计两两组合加入一次性96孔板至第11列、第7行(第12列和第8行为空白对照)。根据最小抑菌浓度的测定，使最高浓度为单药MIC的2倍。抗菌药物按浓度梯度各取50 μL，再加入1.5×105CFU/mL菌液100 μL，37℃过夜培养，观察结果，选择两药联合应用FIC指数最小时作为两种药物的最佳组合，并且以该FIC指数判定两种药物联合应用时的效果。亚胺培南与头孢噻肟钠、丁胺卡那与痢菌净FIC指数测定试验方法同上。

1.2.5 判断标准 FIC指数 =(MIC甲药联用/MIC甲药单用)+(MIC乙药联用/MIC乙药单用)。FIC指数≤0.5，为协同作用;FIC指数在0.5～1范围，为相加作用;FIC指数在1～2范围，为无关作用;FIC指数＞2，为拮抗作用。

2 结果及分析

2.1 亚胺培南与头孢曲松钠MIC试验结果 亚胺培南、头孢曲松钠、头孢噻肟钠、丁胺卡那、痢菌净等5种抗菌药物对大肠杆菌ATCC25922体外最小抑菌浓度如表1所示，可以看到亚胺培南对大肠杆菌ATCC25922最小抑菌浓度最小，这说明了亚胺培南具有很强的抗菌能力。本次试验着重研究了亚胺培南与头孢曲松钠、亚胺培南与头孢噻肟钠联合抗菌效果。

2.2 亚胺培南与头孢曲松钠联合应用对大肠杆菌ATCC25922试验结果 如表2所示，亚胺培南与头孢曲松钠联合应用FIC指数小于0.5，两药联用呈现协同效果。亚胺培南与头孢曲松钠联合应用使两药分别增效8倍与16倍。

2.3 亚胺培南与头孢噻肟钠联合应用对大肠杆菌ATCC25922试验结果 亚胺培南与头孢噻肟钠联合应用FIC值数为0.5，说明两药呈现协同作用(表3所示)。头孢噻肟钠为繁殖期抑菌剂，与亚胺培南联用其效果增强4倍，大大减少了药物用量，提高了药物效果。

表3 亚胺培南与头孢噻肟钠联合应用FIC值

2.4 丁胺卡那与痢菌净联合应用对大肠杆菌ATCC25922试验结果 痢菌净是价格便宜、抗菌效果好的药物，然而其毒性较强，临床应用治疗量与药物中毒量非常接近。痢菌净应用中毒是在养殖中经常出现的问题，与丁胺卡那联合应用可以减少用药量，提高药物效果。如表4所示，丁胺卡那与痢菌净联合应用FIC值小于0.5，呈现协同作用，可以使痢菌净在原有治疗效果上大大减少用药量。

表4 丁胺卡那与痢菌净联合应用FIC值

3 讨论

近年来大肠杆菌耐药性日趋严重，药物预防和治疗用量逐年增加［11］。为减少细菌耐药性和降低药物用量，联合用药是目前有效的解决方法。应用棋盘微量稀释法选取亚胺培南与头孢曲松钠、亚胺培南与头孢噻肟钠、丁胺卡那与痢菌净联合应用，研究其对大肠杆菌的抗菌效果。试验结果显示亚胺培南与头孢曲松钠、亚胺培南与头孢噻肟钠、丁胺卡那与痢菌净联合应用均呈现协同作用。亚胺培南单用时其MIC为0.125 μg/mL，与头孢曲松钠联合应用时MIC为0.0156 μg/mL，其 MIC值降低至原用药量的1/8;亚胺培南与头孢噻肟钠联合应用时亚胺培南MIC值为0.0313 μg/mL，其MIC值降低至原用药量的1/4，同时亚胺培南与头孢曲松钠联合应用使头孢曲松钠增效16倍，而亚胺培南与头孢噻肟钠联合应用使头孢噻肟钠增效4倍。这说明相同类型的药物与亚胺培南联合应用增效倍数不同，是由于这两种药物与细菌的相互作用机制不同所导致。

痢菌净单用时MIC值为16 μg/mL，与丁胺卡那联合应用时MIC值为1 μg/mL，其MIC值降低至原用药量的1/16。痢菌净在临床用药时可以通过与丁胺卡那联合应用降低其药物用量，从而使其用量可以远远低于其中毒剂量。

总之，这几种药物联合应用不但可以减少用药量，并且可以降低细菌耐药性的产生，从而降低用药成本、减少药物残留。

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