离子色谱-积分脉冲安培法测定烟草中18种游离氨基酸

于宏晓，徐海涛，马 强，吕 健，张 晋，岳 勇，赵曰利，肖协忠

（山东中烟工业有限责任公司技术中心，青岛 266101）

烟草中的含氮化合物对烟草的感官评吸质量和吸者健康有重要的影响，历来受到人们的普遍关注。氨基酸是烟草和烟气的香味成分之一，也是烟草中一类重要的致香前体物质。氨基酸的含量与烟草的品质有着密切的关系，其含量的高低直接影响到烟草的味道和烟气的丰满度[1-2]。适量的氨基酸对形成优美的烟草香气和吸味有重要贡献。在烟草调制、醇化和加工直至燃烧过程中，游离氨基酸与还原糖之间可发生酶催化及非酶催化的棕色化反应，生成多种具有烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶类等杂环化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸还可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。因此，准确测定烟草中的游离氨基酸含量对于烟草加工过程中香味物质损失的控制与补偿具有重要的意义。1958年，Moore和Stein等[3-5]首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质水解生成的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化。其后，氨基酸分析技术随着衍生方法、柱载体化学和自动化技术发展而不断提高。

近年来，人们越来越重视氨基酸分析方法的研究与改进，高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法是最近发展起来的无需柱前和柱后衍生的氨基酸直接分析方法，该方法具有快速、灵敏、准确的优点。本试验优化了离子色谱-积分脉冲安培法检测烟草中游离氨基酸方法，采用该方法成功检测了烟草中18种游离氨基酸。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ICS3000多功能离子色谱仪（美国 Dionex公司），电子天平（梅特勒，瑞士），ZP-200振荡器（江苏太仓实验设备厂），Milli-Q®型超纯水系统（美国Millipore公司）。

17种氨基酸混合标准溶液（waters公司），色氨酸（＞99%，生化试剂，Sigma公司），无水醋酸钠（＞99.9%，Dionex公司），50%（w/w）NaOH溶液（Fisher公司），28%～30%氨水（Merck公司），37%HCl（Merck公司）。其他试剂均为分析纯。4 mL SCX固相萃取小柱（Alltech公司）。试验用水均为电阻率18.2 MΩ·cm的超纯水。

1.2 淋洗液配制

分离氨基酸的3种淋洗液（A：超纯水，B：250 mmol/L NaOH，C：1 mol/L NaAc）为了避免NaOH溶液吸收空气中CO2生成Na2CO3降低淋洗液的洗脱效率，应迅速移取13.1 mL 50%NaOH溶液用超纯水稀释至1 L，得到250 mmol/LNaOH淋洗液；称取82.0 g固体NaAc，用超纯水溶解并稀释为1 L，得到1 mol/L NaAc淋洗液。试验时应该在淋洗液上施加氮气保护。

1.3 色谱条件

AminoPac PAl0阴离子交换柱，包括分析柱（250 mm×2 mm）和保护柱（50 mm×2 mm）。采用梯度洗脱方法（表 1），积分安培检测电化学波形（表2）。柱温为32 ℃，流速0.25 mL/min，进样体积25 μL。18种氨基酸标准溶液分离色谱图见图1。

1.4 样品处理和分析

烟叶中含有大量的糖类和色素等物质，这些物质会干扰烟叶中游离氨基酸定量分析，Jandik等[6]采用在线除糖的方法实现了样品中氨基酸的测定。牟世芬和周政华分别采用 DVB强酸性阳离子交换树脂[7]和国产 732型阳离子交换树脂[8]离线除糖的方法测定了游离氨基酸。本研究采用商品化 SCX固相萃取小柱离线除去烟叶中的糖类和色素物质，取烟叶在40～50 ℃条件恒温2 h，粉碎后过80目筛，筛下物为实验用烟样粉末。称取烟样粉末1.0 g，精确至0.001 g，置于50 mL锥形瓶中，加0.06 mol/L HCl溶液20 mL，振摇提取30 min，过滤，取滤液1 mL稀释至10 mL，混合均匀，20000 r/min高速离心30 min，再取上清液1 mL通过SCX固相萃取小柱除去溶液中的干扰游离氨基酸定量分析的糖类和色素等物质，将从 SCX固相萃取小柱洗脱下来的氨基酸洗脱液在65 ℃水浴下氮气吹干，2 mL 0.06 mol/L的HCl溶液定容，用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液作为待测溶液，过 SCX固相萃取小柱后烟叶提取液中18种游离氨基酸的色谱图见图2。

表1 分离18种游离氨基酸的淋洗梯度条件Table1 Gradient condition for analyzing 18 amino acids

表2 18种游离氨基酸的积分安培检测电化学波形Table2 Detection waveform for 18 amino acids

图1 8种游离氨基酸标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of 18 standard amino acids

图2 烟叶提取液中18种游离氨基酸的色谱图Fig.2 Chromatograms of 18 free amino acids in the tobacco extraction solution

2 结 果

2.1 线性范围与回收率

该方法用于氨基酸的检测，灵敏度高，检出限在 0.03～0.75 μg/mL（25 μL 进样），线性范围较宽，达到2～3个数量级，相关系数在0.9900～0.9992，离线除去糖类和色素等干扰物质后，18种氨基酸的回收率都在80%～115%，因此该方法可用于烟草中18种游离氨基酸的分析检测。

2.2 烤烟、白肋烟和香料烟不同类型单料烟中游离氨基酸的对比分析

对比烤烟、白肋烟和香料烟不同类型单料烟中游离氨基酸的含量（表3），这3种不同类型的单料烟中游离氨基酸的含量存在着很大差别，白肋烟的游离氨基酸的总量最高，同时白肋烟的精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、色氨酸的含量远远高于烤烟和香料烟的含量。烤烟的脯氨酸和蛋氨酸的含量高于白肋烟和香料烟的含量。香料烟的缬氨酸和酪氨酸的含量高于烤烟和白肋烟的含量。

表3 烤烟、白肋烟和香料烟中18种氨基酸的含量 mg/gTable3 The contents of 18 free amino acids in flue-cured tobacco, burley tobacco and oriental tobacco

2.3 国内外烤烟型和混合型卷烟中游离氨基酸对比分析

对比国内外烤烟型和混合型卷烟游离氨基酸的含量（表 4）看出，混合型卷烟的精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸的含量明显高于烤烟型卷烟的含量，同时混合型卷烟的总游离氨基酸的含量也明显高于烤烟型卷烟的含量。主要是由于混合型卷烟配方中含有白肋烟，而白肋烟中精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸的含量和游离氨基酸总量明显高于烤烟。烤烟型卷烟的蛋氨酸和脯氨酸的含量明显高于混合型卷烟的含量，是因为烤烟的脯氨酸和蛋氨酸的含量高于白肋烟的含量。国内外烤烟型和混合型卷烟游离氨基酸的差异性规律进一步佐证了烤烟和白肋烟游离氨基酸的差异性规律。

表4 国内外烤烟型和混合型卷烟18种游离氨基酸的含量 mg/gTable4 The contents of 18 free amino acids in flue-cured cigarettes and blended cigarettes

3 结 论

离子色谱-积分脉冲安培法具有快速、灵敏和准确的优点，与已有的其他分析烟草中游离氨基酸的方法相比，具有所需试剂简单、无需柱前或柱后衍生的特点。利用该方法测定了不同类型单料烟和国内外不同风格卷烟中 18种游离氨基酸的含量。结果表明，白肋烟的游离氨基酸的总量最高，混合型卷烟的总游离氨基酸的含量明显高于烤烟型卷烟的含量，其他游离氨基酸的含量随着烟草的类型和风格的不同也存在着明显的差异。

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[4]Spackman D H，Stein W H, Moore S.Automatic Recording Apparatus for Use in Chromatography of Amino Acids[J].Anal.Chem., 1958, 30(7): 1190-1206.

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[7]Ding Y S, Yu H, Mou S F.Off-line elimination of carbohydrates for amino acid analysis of samples with high carbohydrate content by ion-exchange chromatography [J].J.Chromatogr.A, 2003, 997(1/2):155-160.

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