头穴丛刺法对急性脑梗死大鼠行为学及凋亡相关基因bcl-2的影响①

朱文增，倪金霞，盛国滨，于致顺

·基础研究·

头穴丛刺法对急性脑梗死大鼠行为学及凋亡相关基因bcl-2的影响①

朱文增1，倪金霞2，盛国滨3，于致顺3

目的 探讨头穴丛刺对急性脑梗死大鼠神经行为学及凋亡相关基因bcl-2的影响。方法将72只雄性Wistar大鼠随机分为3组：假手术组(A)、造模组(B)和头穴丛刺组(C)，每组各24只。各组再根据脑梗死后不同时间分为6 h、24 h和3 d三个亚组，每个时间点各8只。采用线栓法制备急性脑梗死动物模型，观察不同时间点头穴丛刺法对急性脑梗死大鼠行为学及脑组织凋亡相关基因bcl-2表达的影响。结果脑梗死第3天，C组大鼠神经功能评分明显低于B组(P＜0.01)；C组大鼠术后不同时间点缺血半暗区bcl-2的表达增多，24 h时达到高峰，与B组比较差异均具有高度显著性差异(P＜0.01)。结论头穴丛刺能明显降低急性脑梗死大鼠神经功能评分，促进运动功能恢复；并可促进大鼠缺血半暗区bcl-2的表达，抑制细胞凋亡。

脑梗死；大鼠；头穴丛刺；bcl-2；神经功能评分

[本文著录格式]朱文增，倪金霞，盛国滨，等.头穴丛刺法对急性脑梗死大鼠行为学及凋亡相关基因bcl-2的影响[J].中国康复理论与实践,2012,18(10):927-929.

头穴丛刺法是于致顺教授在总结多年临床经验的基础上提出的一种治疗脑病的新方法。本研究通过观察头穴丛刺法对脑梗死大鼠行为学和神经细胞凋亡相关基因bcl-2的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性Wistar大鼠，体重250～300 g，皮毛光滑润泽，呼吸道通畅，足部皮肤红润，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。将72只大鼠随机分为假手术组(A)、造模组(B)和头穴丛刺组(C)，每组24只。各组再分为6 h、24 h、3 d三个时间点，每个时间点各8只。

1.2 主要器械设备及试剂 华佗牌针灸针(苏州医疗用品厂)；JSJ-1组织脱水机(天津航空机电公司)；BMJ-1生物组织包埋机(天津航空机电公司)；LEICA切片机(德国)；ZDJ-1型展片机(天津航空机电公司)；KDJ-1型烤片机(天津航空机电公司)；CH-2型光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；CH型摄影显微镜(日本OLYMPUS公司)；Bcl-2一抗试剂盒(北京中山试剂公司)；二步法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；多聚甲醛(天津市科密欧化学试剂有限公司)；水合氯醛(昆山市石浦年沙助剂厂)。

1.3 模型制备 采用线栓法制备大脑中动脉闭塞(middle cerebralartery occlusion,MCAO)大鼠模型。选用直径0.20～0.25mm的强力钓鱼线，剪成长40mm的栓线，线前端经酒精灯处理形成光滑球形，在手术显微镜下观察其光滑程度，不合格的剔除，合格栓线消毒后放入生理盐水中备用。室温条件下，大鼠称重后，用10%水合氯醛3.5m l/kg腹腔麻醉后，仰卧固定在手术台上，颈部备皮，常规消毒后行正中切口，钝性分离并结扎左侧颈外动脉(ECA)和颈总动脉(CCA)近心端，并于CCA远心端备线并打一活结，钝性分离颈内动脉(ICA)，在ICA远心端用微动脉夹夹闭，在CCA分叉部切一小口，将与体重相应直径的栓线插入，收紧备线，打开动脉夹，栓线进入ICA，轻柔推进，至有阻力不能再进即停止推送，此时钓鱼线头端已达大脑中动脉开口处，进线长度为17～21mm(距分叉处)，扎紧备线，缝合，切口局部撒消炎粉。假手术组只分离动脉，不结扎、不插线。模型成功的标志是[1]：左侧Horner征(+)，右前肢瘫痪，大鼠麻醉清醒后提尾悬空时右侧前肢内收、屈曲，自主运动时身体向右侧转圈。不合格的动物剔除。

1.4 操作方法 假手术组大鼠术后置于普通笼中饲养；造模组术后另置普通笼中饲养，不予以任何治疗；头穴丛刺组大鼠术后6 h即进行头针治疗，采用丛刺法，取百会穴及百会左、右侧各旁开4mm处针刺，快速捻转1min后留针30m in，每个观测时间点针刺1次。对各组大鼠术后6 h、24 h、3 d进行神经功能评定后，均开胸暴露心脏，先后用0.85%盐水及福尔马林溶液各100m l心脏灌注，以将大鼠体内血液冲净(从右房流出的液体变清)为宜，然后断头取脑，将脑组织放入福尔马林溶液中固定，以备免疫组织化学检测。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 行为学评估 神经功能评定按Bederson等[2]制定的标准评分，评分分为4级。0级(分)：未见行为缺陷；1级(分)：前肢屈曲；2级(分)：侧推抵抗力下降(即侧向推力实验阳性)伴前肢屈曲，无转圈行为；3级(分)：同2级行为伴自发性旋转。

1.5.2 免疫组化染色程序 二甲苯脱蜡、酒精脱苯，PBS冲洗2min×3次，水化组织切片；3%H2O2去离子水孵育10m in，阻断内源性过氧化物酶；枸橼酸钠高压修复2min，PBS冲洗2m in×3次；滴加一抗置入4℃冰箱过夜，PBS冲洗2m in×3次；滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育20m in，PBS冲洗2 m in×3次；DAB显色；自来水充分冲洗；1%苏木素复染，自来水冲洗5m in；梯度酒精脱水，二甲苯透明；封片剂封片。

结果判定：每张切片不同部位在显微镜的目镜下选4个视野，观察bcl-2阳性细胞数目，取其平均值。bcl-2神经元胞浆呈棕黄色染色为阳性。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。组间均数比较采用q检验，以P＜0.05作为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分 模型组在3 d时神经功能评分与6 h评分比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，头穴丛刺组在3 d时神经功能评分明显减少，与6 h、24 h比较(P＜0.05，P＜0.01)。与假手术组比较，模型组、头穴丛刺组大鼠造模后不同时间点神经功能评分有显著性差异(P＜0.05)；与模型组比较，头穴丛刺组大鼠在治疗3 d后神经功能评分明显低于模型组(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点神经功能评分比较

2.2 bcl-2表达 模型组术后不同时间点在缺血半暗区bcl-2均有不同程度的表达增多，24 h时达到高峰，均高于组内其它时间点(P＜0.05)。头穴丛刺组bcl-2亦在24 h时表达最明显。模型组和头穴丛刺组与假手术组在6 h、24 h、3 d时间点比较，均有高度显著性差异(P＜0.01)；头穴丛刺组在6 h、24 h、3 d时间点与模型组比较，bcl-2表达均明显增高(P＜0.01)。见表2。

表2 不同时间点各组大鼠缺血半暗区bcl-2表达的比较(阳性细胞数)

3 讨论

3.1 头穴丛刺法对大鼠MCAO后行为学的影响 神经功能评估反映缺血性脑损伤的程度，而且与皮层缺血坏死神经元的数目密切相关。本实验采用Bederson神经功能评分对比观察各组大鼠MCAO术后不同时间神经行为的改变。结果显示，组内比较，模型组在6 h、24 h时神经功能评分比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但在3 d时神经功能评分低于6 h评分组(P＜0.05)，可见随着缺血时间的延长，模型组大鼠神经功能缺损在一定程度上存在自发性的恢复过程；头穴丛刺组3 d神经功能评分明显低于6 h针刺组和24 h针刺组(P＜0.05，P＜0.01)。与模型组比较，头穴丛刺组在术后6 h、24 h比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，这可能与大鼠MCAO术后脑水肿程度较重有关，而头穴丛刺治疗3 d后，神经功能评分减少明显低于模型组(P＜0.01)，该结果在一定程度上反映针刺量的累积直接影响脑梗死的治疗疗效，早期进行头穴丛刺治疗能明显改善大鼠的神经功能评分，方法简单，疗效确切。其针刺效应的发挥可能为：通过丛刺头部穴区，改变脑皮层神经细胞的兴奋性，纠正抑制性泛化，使可逆性神经细胞复活或被抑制的神经细胞觉醒，从而促进神经功能的恢复。

3.2 抑凋亡基因bcl-2与脑梗死 bcl-2是一种重要的抑制神经元凋亡蛋白，可以通过与促凋亡蛋白形成异源二聚体从而达到抑制凋亡的目的，在维持神经细胞存活方面发挥着关键作用。脑缺血后bcl-2的过量表达可抑制由于谷氨酸释放、血清及生长因子缺乏、膜过氧化和自由基等刺激诱导的中枢神经细胞死亡。bcl-2基因治疗对缺血性脑梗死有明显治疗作用，是保护神经细胞在遭受致命损伤后免于死亡的一种积极生存机制。在大鼠局灶脑缺血模型中，bcl-2阳性细胞表达水平随缺血时间及再灌流时间呈动态变化。蒋氏等发现，在脑缺血再灌注的早期梗死灶周边即有bcl-2蛋白开始表达，3～6 h达到高峰，24 h开始逐渐降低[3]。冯氏等研究表明，脑缺血2 h再灌注2 h后bcl-2表达升高，6 h达到高峰，12 h开始下降，随着脑缺血再灌注时间延长脑损伤加重，bcl-2蛋白表达减少[4]。于氏等报道，大鼠全脑缺血再灌注损伤后bcl-2表达至再灌注12 h达高峰，再灌注24～72 h逐渐减弱[5]。张氏等观察到，脑缺血再灌注早期bcl-2蛋白即有表达，再灌注24 h达高峰后逐渐降低[6]。陈氏等在观察脑缺血预处理对bcl-2表达的影响时发现，大鼠皮质和纹状体缺血区域bcl-2表达于缺血预处理再灌注1 d时明显增加，再灌注3 d时达高峰，以后逐渐下降，第7天仍高于空白对照组水平[7]。

本研究结果显示，大鼠MCAO后不同时间点在缺血半暗区bcl-2均有不同程度的表达增多，24 h达到高峰，随后bcl-2表达下降。脑缺血后bcl-2峰值出现时间的差异可能与动物模型建立的方法不同有关。

有研究发现，大鼠脑缺血后不同时间Bcl-2及Bax蛋白的表达水平发生变化，认为Bcl-2/Bax的比例失衡可能是大鼠脑缺血后神经细胞凋亡的机制之一[8-10]。关于针刺对脑缺血大鼠凋亡相关基因的影响，学者们有不同的体会。如针刺百会、大椎穴可上调脑缺血再灌注大鼠脑组织海马区bcl-2蛋白的表达、下调Bax蛋白的表达，减轻脑损害[11]；早期针刺足三里、外关穴，可使急性脑梗死大鼠梗死灶周围组织中bcl-2的表达增高，Bax表达下降，从而保护脑神经细胞[12]；大鼠局灶性脑缺血后6 h、24 h、48 h、72 h不同时间点，电针百会、曲鬓、前顶穴均可使半暗带Bcl-2蛋白的表达增多，而6 h、24 h、48 h时间点，Bax蛋白的表达减少，从而抑制神经细胞凋亡[13]；另有研究报道，不同的针刺方法也可促进脑梗死大鼠缺血半暗区bcl-2的表达[14-16]，抑制促凋亡因子Bax的表达[16-17]，使Bcl-2/Bax相对升高，从而减轻脑缺血时神经功能障碍。

本研究结果显示，头穴丛刺可通过促进MCAO大鼠缺血半暗区bcl-2的表达，抑制神经细胞凋亡，挽救缺血半暗区神经细胞的功能，从而降低脑梗死后的致残率，为该方法在临床的推广应用提供了实验证据。

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Effects of Cluster Scalp Acupuncture on Behavior and Apoptosis-related Gene bcl-2 in Rats after Acute Cerebral Infarction

ZHU Wen-zeng,NIJin-xia,SHENGGuo-bin,etal.Guang'anmen Hospital,China Academy ofChineseMedicine Sciences,Beijing 100053,China

ObjectiveTo explore the effects of cluster scalp acupuncture on the behaviorand expression of bcl-2 in rats after acute cerebral infarction.M ethods72maleWistar ratswere random ly divided into sham operation group(A),modelgroup(B)and cluster scalp acupuncture group(C),24 rats in each group.According to time after cerebral infarction,each group was reassigned to 6 h,24 h and 3 d subgroups,8 rats in each subgroup.The acute cerebral infarctionmodelwasestablished w ith themiddle cerebralartery occlusion.The effectsof cluster scalp acupuncture on the behaviorand expression of apoptosis-related genebcl-2 in the ratbrain tissuesw ith acute cerebral infarction were tested atdifferent time.Results3 d after cerebral infarction,the score of neuronal function in group Cwas significantly lower than that of group B(P＜0.01).The expression of bcl-2 in brain ischem ic penumbra increased in group C atdifferent time and reached its peak at24 h. Compared w ith group B,therewas a statistical difference(P＜0.01).ConclusionCluster scalp acupuncture can significantly reduce the neuronal function score of ratsafter acute cerebral infarction and then promote the recovery ofmovement function.The therapy can inhibit the apoptosisby increasing theexpression of bcl-2 in penumbra zoneof cerebral infarction.

acute cerebral infarction;rats;cluster scalp acupuncture;bcl-2;neuronal function score

R743.3

A

1006-9771(2012)10-0927-03

2012-08-17

2012-08-28)

1.黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11511373)；2.哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目(2007RFQXS109)。

1.中国中医科学院广安门医院针灸科，北京市100053；2.北京中医药大学东直门医院，北京市100700；3.黑龙江中医药大学附属二院，黑龙江哈尔滨市150001。朱文增(1971-)，男，安徽砀山县人，中西医结合博士后，副主任医师，主要研究方向：针刺对中风可塑性影响的研究。通讯作者：倪金霞。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.10.009