心肌微环境下丹酚酸B诱导MSCs向心肌样细胞分化的研究*

张云莎，薛 亮，范英昌

（1.天津中医药大学病理教研室，天津 300193；2.天津中医药大学中医学院，天津 300193）

心肌微环境下丹酚酸B诱导MSCs向心肌样细胞分化的研究*

张云莎1，薛 亮2，范英昌1

（1.天津中医药大学病理教研室，天津 300193；2.天津中医药大学中医学院，天津 300193）

[目的]复制心肌缺血-再灌注损伤模型，体外模拟心肌缺氧复氧微环境，观察丹酚酸B（SalB）诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的作用。[方法]通过向MSCs培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法，体外模拟心肌微环境。自成年大鼠骨髓中分离MSCs，设对照组（A组）、心肌细胞裂解液（TJ）组（B组）、SalB组（C组）、TJ+SalB组（D组）。培养4周，观察细胞形态，并采用免疫荧光技术检测cTnT的表达。[结果]除A组MSCs无明显的肌样细胞形成，各诱导组均有肌样细胞分化，D组与C组相比，cTnT表达率明显增高，差异有统计学意义。[结论]心肌细胞裂解液可以诱导MSCs向心肌样细胞分化；心肌微环境的建立有利于SalB诱导MSCs向心肌样细胞分化。

骨髓间充质干细胞；心肌样细胞；丹酚酸B；心肌微环境

在组织工程中，骨髓间充质干细胞（MSCs）作为一种重要的种子细胞引起人们越来越多的关注，其中因能分化为心肌样细胞备受关注[1]。但单纯依赖MSCs移植，分化为心肌样细胞的数量有限，难以起到代偿作用。因此，如何提高MSCs的分化率是细胞移植的关键。笔者前期研究表明，中药单体丹酚酸B（SalB）可以诱导MSCs向心肌样细胞分化，但单纯的SalB对MSCs的诱导率有待提高。移植细胞所处的微环境是影响MSCs分化的重要因素，本实验将制备缺氧复氧心肌裂解液体外模拟心肌缺血再灌注的微环境，观察SalB对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导作用。

1 材料与方法

1.1 材料 SD成年大鼠及乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：SCXK（京）2005-0001；DMEM低糖培养基（Hyclone公司）；优质胎牛血清（Gibco公司）；Percoll’s细胞分离液（Pharmacia公司）；cTnT抗体（Santacruze公司）；FITC连接的兔抗山羊IgG（Santacruze公司）；0.1%Ⅱ型胶原酶（Sigma公司）；胰蛋白酶（S igma公司），4，6-二乙酰基-2-苯基吲哚（DAPI，S igma公司），Triton－X－100（AMRESCO公司）；BrdU（上海浩然生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 缺氧复氧心肌细胞裂解液（条件培养液）的配置

1.2.1.1 心肌细胞的分离与培养 参照文献[2]，无菌操作下取乳鼠心脏，留心尖部，经过漂洗，剪切，胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化，加含10%胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化后，收集上清液，200目的尼龙网筛过滤去除残留组织块，离心获得的细胞与培养液混悬后，采用差速贴壁分离法去除心肌成纤维细胞，将未贴壁的心肌细胞悬液吸出，调整细胞密度接种于培养板中。培养前3 d加入0.1mmol/L BrdU抑制成纤维细胞生长[3]。48 h首次换液，以后根据情况2～3 d换液。

1.2.1.2 缺氧复氧心肌细胞裂解液的配置 取培养好的心肌细胞进入实验。实验前换以无血清的培养基培养心肌细胞24 h，使细胞生长同步化。将培养瓶置于95%N2+5%CO2培养箱，37℃恒温，饱和湿度，持续缺氧培养4 h，再放置于95%O2+5%CO2培养箱复氧过夜培养。次日，将培养的心肌细胞制成细胞悬液，迅速置于-70℃冰箱中，约4～5 h后取出融化，用吸管反复吹打细胞悬液，如此反复3次后将细胞裂解液在2000 r/min的条件下离心10min，将上清用0.45μm的滤器过滤后备用[4]。

1.2.2 MSCs的分离与培养 大鼠MSCs的分离与培养参照前期研究所采用的方法进行[5]。

MSCs的诱导分化：取生长较好的第3代MSCs做如下处理，共诱导4周。对照组（A组），MSCs仅在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养；心肌细胞裂解液组（B组），MSCs培养体系中加入50%的心肌细胞裂解液，隔日换液，每次换液均加入相同量的心肌细胞裂解液；SalB组（C组），MSCs培养体系中加入16mg/L的SalB孵育24 h后，换新鲜完全培养基继续培养，隔日换液；TJ+SalB组（D组），MSCs培养体系中加16mg/L的SalB孵育24 h后，换含50%心肌细胞裂解液培养液的培养基继续培养，隔日换液。

1.2.3 诱导后MSCs的cTnT蛋白免疫荧光表达检测 按上述实验分组给予不同处理后弃除培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，以预冷的4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3次，0.5%Triton-X-100穿孔15min。10%正常兔血清封闭30min后，加入一抗cTnT（1∶100稀释）4℃过夜，再加兔抗羊 FITC-IgG室温孵育2 h，DAPI复染核5min，甘油封片，荧光显微镜激发照相。然后用共聚焦显微镜将“DAPI”与“FTIC”图像合成。若观察到双阳性细胞即胞核呈蓝色荧光胞浆呈绿色荧光，则提示MSCs向心肌样细胞发生了定向分化。

每组随机选取8张染色的细胞爬片，于200倍镜下每张片选5个不同的视野，数码相机拍摄后，计数阳性细胞率。

2 结果

2.1 心肌细胞的形态 在倒置相差显微镜下观察，刚分离的心肌细胞呈圆形，培养2 h后成纤维细胞基本完全贴壁，而少数心肌细胞8 h左右开始贴壁，少数贴壁的单个心肌细胞出现了自发性搏动，搏动的频率、节律各不同。24 h后搏动的心肌细胞百分率大约为50%，搏动频率较分散，约30～50次/min。至48 h视野下细胞呈梭形，板形，三角形或扁平不规则形，折光度较高，细胞中隐约可见细胞核，搏动的心肌细胞百分率大于90%，搏动频率多集中在50～80次/min，72 h后细胞充分铺展，贴壁牢固，少数局部均一搏动频率，可达80～100次/min。

2.2 MSCs形态 原代细胞接种24 h后，培养瓶底即出现少许贴壁细胞，多呈纺锤形或梭形，有少量细胞已开始增殖，成纤维细胞样，聚集生长，少有单个分散状态。随着培养时间延长，贴壁细胞明显增多，集落逐渐增大，呈放射状排列。传代细胞密度分布均匀，细胞生长也均匀一致。

2.3 MSCs诱导后形态学观察 A组无肌样细胞出现。B组MSCs在心肌细胞裂解液的作用下，有聚集生长的趋势，可见大量成片的肌样细胞及圆形的子代细胞。C组细胞生长状态较好，脱壁或降解的细胞数量少，随着诱导时间的推移，部分视野形成肌丝样结构。D组细胞有聚集生长的趋势，随着时间的推移，细胞形态趋于一致，排列具有方向性，部分视野可以观察到明显的肌丝样结构。

2.4 诱导后MSCs的cTnT蛋白免疫荧光表达 除对照组组外，各诱导组cTnT均有一定程度的表达；与C组相比，D组cTnT的表达明显上升，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1，图 1。

表1 各诱导组MSCs的cTnT阳性表达率（±s）Tab.1 Positive cTnT expression rateofM SCs in each group（±s）%

表1 各诱导组MSCs的cTnT阳性表达率（±s）Tab.1 Positive cTnT expression rateofM SCs in each group（±s）%

注：D组与C组比较，*P<0.05。

组别 n 阳性表达率A 8 0 B 33.72±9.74 C 8 15.63±2.28 8 D 835.34±7.66*

3 讨论

由于MSCs向特定细胞分化的能力受局部微环境的调控，而单纯药物刺激难以模拟体内微环境，目前认为，在体外通过成体干细胞与目的细胞共培养能在一定程度上“再现”体内微环境并成功诱导干细胞定向分化。原代培养心肌细胞与MSCs接触是促进MSCs向心肌样细胞分化的重要因素，两种细胞间的接触通讯使MSCs接受了向心肌方向定向分化的特异性信号。因此有研究认为干细胞定向分化为心肌细胞时可能主要受3个因素的影响：干细胞与心肌细胞间的物理接触；心肌细胞单独分泌化学信号；干细胞与心肌细胞接触后心肌细胞分泌化学信号。近几年，通过向MSCs培养体系中添加心肌细胞裂解液，体外模拟心肌微环境，免疫组化分析发现分化后的细胞表达了α-肌动蛋白、心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43及CD31。研究还发现单独的心肌细胞裂解液可诱导MSCs表达pl受体和脑钠素。心肌细胞在缺血缺氧的情况下，能调动其应激机制，分泌多种细胞因子[4]。曾俊义[6]则采用自体心肌匀浆上清液诱导人骨髓间充质干细胞，持续作用2周，研究发现心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞具有向心肌样细胞定向诱导的作用。实验结果证实，干细胞所处的微环境是影响其定向分化的重要因素。

丹酚酸B是治疗心血管疾病常见用药丹参的主要有效成分，动物实验表明SalB具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用[7]，并对大鼠急性心肌缺血具有保护作用[8]。冉玉琴等[9]则从电生理学角度研究发现SalB通过调节钾离子和钙离子的流动达到抗心律失常的功效。除了给与中药改善心功能外，移植骨髓干细胞分化为心肌细胞是治疗缺血性心脏病的新希望，笔者的前期研究[5，10]表明，SalB能诱导MSCs向心肌样细胞分化，但诱导率有待提高。

本研究采用的心肌细胞裂解液是通过将新生大鼠的心肌细胞缺氧复氧后反复冻融裂解离心、过滤得到的，一定程度上“再现”了心肌缺血再灌注损伤，模拟了体内心肌微环境。本实验证实心肌细胞裂解液可以诱导MSCs向心肌样细胞分化，并且发现在模拟的心肌微环境下，中药单体SalB对MSCs的诱导率明显提高，这对于体内移植MSCs同时给予中药干预的缺血性心脏病患者来说是一可喜的现象。

[1]Takeo K,Toshio H,Katsuya O,etal.A neurosphere-derived factor,cystatin C,wupportsdifferentiation of EScells intoneuralstem cells[J].Pnas,2006,103(5):6019-6024.

[2]何 伟，张明雪，闫丽娟.乳鼠原代心肌细胞培养概要[J].实用心脑肺血管病杂志，2009，17（3）：339－340.

[3]MiragoliM,GaudesiusG,Rohr S.Electrotonicmodulation of cardiac impulse conduction by myofibroblasts[J].Cirac Res,2006,98(6):801-810.

[4]吕学详，曾秋棠.心肌细胞裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化作用[J].临床心血管病杂志，2008，16（2）：217－219.

[5]徐秀梅，郭茂娟，赵 旭，等.丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究[J].时珍国医国药，2008，19（3）：574－576.

[6]曾俊义，魏云峰，汪 泱，等.人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化及相关基因时序表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（23）：4181－4185.

[7]王保和，傅 伟.丹酚酸B对急性心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌保护作用的机制研究[J].天津中医学院学报，2004，23（3）：12－15.

[8]胡旭光，相 湘，杨超燕，等.丹酚酸B对实验性大鼠急性心肌缺血的保护作用[J].广东医学，2010，31（3）：334－336.

[9]冉玉琴，李 宁，王蓉蓉，等.丹酚酸B对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流和L型钙电流的阻滞作用[J].中国心脏起搏与心电生理杂志，2010，24（4）：344－348.

[10]华声瑜，范英昌，马铁文，等.丹酚酸B对大鼠骨髓间充质干细胞分化过程中Desmin、α-actinmRNA表达的影响[J].天津中医药，2009，26（2）：145-148.

Study on differentiation ofmesenchymalstem cells into cardiomyocyte-like cells induced by SalB in cardiacm icro-environment

ZHANGYun-sha1,XUE Liang2,FANYing-chang1
（1.PathologicalStaffRoom,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.College of Tradition ChineseMedicine,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,Ch in a）

[Objective]To reproduce themodelofmyocardial ischemia-reperfusion injury to simulate cardiacmicro-environment in vitro and observe the effectSalB in the process ofmesenchymalstem cells(MSCs)differentiating into cardiomycyte-like cells.[Methods]A myocardium micro environmentwas simulated in vitro by addingmyocardial cell lysate to MSCs culture system.MSCswasobtained from adult rats'bonemarrow,and divided into four groups:the controlgroup(group A),myocardio cell lysate group(TJ,group B),SalB group(group C)and TJ+SalB group(group D).They were cultivated for fourweeks,and then themorphology was observed and the cTnT expressionwasdetected by immune fluorescence detection technology.[Results]Each induced group hadmyocardial-like celldifferentiation exceptgroup A.Compared with group C the cTnTexpression in Group Dwas themostobviouswith a statisticalsignificance between them.[Conclusion]Myocardial cell lysate can induceMSCs differentiating into cardiomyocyte-like cells.Cardiacmicro-environmentcan contribute SalB to induce differentiation ofMSCs into cardiomyocyte-like cells.

mesenchymalstem cells;cardiomyocyte-like cells;SalB;cardiacmicro-environment

R542.2

A

1672-1519（2012）03-0278-03

高等学校博士学科点专项科研基金项目（201012 10110004）；天津市自然科学基金项目（09JCYBCI12200）。

张云莎（1984-），女，硕士，助教，研究方向为中医药防治心脑血管疾病。

范英昌。

2011-12-22）