实验性糖尿病鼠大血管病变TGF-β1和CTGF的表达及中药的干预作用*

王 军，徐 阳，袁向科，张学勇，丁志明

（天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

实验性糖尿病鼠大血管病变TGF-β1和CTGF的表达及中药的干预作用*

王 军，徐 阳，袁向科，张学勇，丁志明

（天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

[目的]通过观测实验性糖尿病鼠大血管病变中转化生长因子（TGF-β1）和结缔组织生长因子（CTGF）相关表达，揭示糖尿病大血管病变的发病机制。并通过中药干预的观察，明确中药在预防和治疗糖尿病大血管病变的靶点。[方法]雄性SD大鼠80只，其中正常对照组10只，70只造糖尿病模型并随机分为5组：模型组（n=14），中药高、中、低剂量组（n=14），二甲双胍组（n=14）。6组大鼠均予普通饲料加干预喂养12周后，取股动脉，应用免疫组化法观察糖尿病（DM）大鼠大血管中CTGF、TGF-β1表达的部位及其变化。[结果]TGF-β1主要在胞浆中表达。模型组TGF-β1表达呈强阳性反应，中药干预组TGF-β1表达明显下降（P＜0.01），二甲双胍对TGF-β1表达有影响，但与中药高剂量组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。C TGF在模型组血管管壁下层细胞浆可见大量棕黄色物质表达呈强阳性反应，各药物干预组血管细胞CTGF表达都明显下降（P＜0.01），中药高剂量组与西药对照组表达比较差异有统计学意义。[结论]1）糖尿病大血管病变可能与纤维化有关。2）中药组方加味桃核承气汤能有效降低致纤维化因子TGF-β1、CTGF在实验性糖尿病鼠大血管病变中的表达。其对DM大血管病变有改善作用，并存在剂量依赖关系。

2型糖尿病；大血管病变；纤维化；中药；结缔组织生长因子；转化生长因子-β1；免疫组化

大血管病变是糖尿病（DM）常见的并发症之一，是糖尿病患者致残和致死的最主要原因之一。糖尿病血管并发症的发病机制存在多种学说，目前公认的主要有糖基化终末产物（AGEs）学说和氧化应激等学说。笔者在前期研究中发现：糖尿病患者截肢标本中，血管病变是以内膜的纤维性增厚为主，仅有极少部分患者出现粥样硬化斑块，而且脂质沉积特点与单纯动脉粥样硬化并不相同，纤维成分所占比例大，在电镜下也看到同样的结果。既往现代医学对于糖尿病大血管并发症研究和治疗都是基于动脉粥样硬化角度的，对于其纤维化病变都未予重视，认为有可能从胶原纤维沉积的角度突破，以便更好的揭示糖尿病动脉损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠80只，清洁级，2月龄，体质量200～250 g，由天津实验动物中心提供。

1.1.2 实验药物 加味桃核承气汤（桃仁10 g，大黄 6 g，桂枝 6 g，甘草 3 g，芒硝 6 g，黄芪 30 g，生地15 g，麦门冬12 g，玄参12 g），减压浓缩至浓度为0.76 g/mL，大鼠用药剂量为生药6.07 g/（kg·d）。由天津中医药大学第一附属医院制剂室按水煎醇沉工艺制备，4℃冰箱保存备用。

盐酸二甲双胍片：0.25 g/片，100片/瓶，天津太平洋制药有限公司生产，药品研碎与生理盐水配成0.1%的溶液。成人推荐剂量为1.5 g/70（kg·d），大鼠相当于人的等效剂量为0.14 g/（kg·d）。

生理盐水：天津大冢制药有限公司生产。

精蛋白锌胰岛素注射液：400U/瓶。由江苏万邦生化医药有限公司生产。

1.1.3 实验仪器 血糖仪：德国罗氏活力型血糖仪。显微镜：日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11。多功能真彩色细胞图像分析管理系统：美国Media Cybernetics公司Image-ProPlus。切片机：德国莱卡RM2015。离心机：北京离心机厂LDZ5-2型。

1.1.4 实验试剂 SP免疫组化试剂盒：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。浓缩型DAB显色剂试剂盒：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。多聚赖氨酸：美国SANTA CRUZ公司。兔抗鼠转化生长因子-β1（TGF-β1）多克隆抗体：美国 SANTA CRUZ公司。枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液（PBS）：由天津市南开医院病理室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 正常对照组（n=10，A组），造模成功的70只大鼠采用随机数字表法随机分为5组：糖尿病模型组（n=14，B组），糖尿病+加味桃核承气汤高剂量治疗组（n=14，C组），糖尿病+加味桃核承气汤中剂量治疗组（n=14，D组），糖尿病+加味桃核承气汤低剂量治疗组（n=14，E组），糖尿病+二甲双胍治疗组（n=14，F组）。大鼠非禁食状态下血糖维持在25mmol/L。

1.2.2 实验干预 5组大鼠全部予普通饲料喂养，每日给予适量长效胰岛素皮下注射，前5周每周2次尾静脉取血测血糖，后7周每周1～2次监测血糖，B、C、D、E、F 组维持非禁食状态血糖 25mmol/L。

同时，A组和B组给予0.9%生理盐水10mL/kg灌胃，每日 1次，C、D、E 组按 10、7.5、5mL/kg给予中药灌胃，每日1次，F组以二甲双胍0.14 g/（kg·d）溶于10mL生理盐水中灌胃。

1.3 检测分析

1.3.1 观察指标 TGF-β1、结缔组织生长因子（CTGF）。

1.3.2 取材 按照上述方法饲养大鼠12周后，禁食24 h后，用10%的水合氯醛3 g/k g，麻醉，仰卧位固定大鼠,备皮、消毒、铺巾。沿股动脉走向纵向切开皮肤,用蚊式钳钝性分离组织，以暴露股动脉鞘，其中呈粉红色且触之有搏动的粗大血管即为股动脉。用眼科镊钝性分离截取股动脉约4～5 cm。PBS冲洗，4%多聚甲醛固定，经70%～100%乙醇各30min共8次，二甲苯透明30min两次冲洗，55℃石蜡中30min两次，用铜制模具包埋组织块；将厚度5μm的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜备用。

1.3.3 标本TGF-β1免疫组化检测 1）脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯中5min两次、100%～75%乙醇5 min共8次，再以自来水冲洗、PBS洗两次。2）1%甲醇双氧水、0.1mol/LPBS洗。3）滴加抗原修复液，0.1mol/LPBS洗。4）滴加正常山羊血清封闭液不洗。5）滴加第一抗体，4℃过夜，0.1mol/L PBS洗 3次。6）滴加生物素化第二抗体（IgG），37 ℃ 20 min，0.1mol/LPBS洗3次。7）滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃ 20min，0.1mol/L PBS洗3次。8）D AB显色：使用DAB显色试剂盒1mL蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色6min，充分水洗。9）苏木素复染细胞核中性树脂封片。

镜观采相分析：以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。定量分析采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，每张切片在高倍镜下（×400）随机选取10个视野并摄像保存，采用IMAGE PRO PLUS软件设置阳性表达的宏程序，在同一条件下，分析不同组别的TGF-β1含量，对阳性表达率进行组间比较。

1.3.4 标本CTGF免疫组化检测 所用载玻片均经多聚赖氨酸处理，连续切片厚4μm，一抗为兔抗CTGF和兔抗TGF-β1多克隆抗体，二抗为生物素化羊抗兔IgG，以0.01mol/LPBS代替一抗作阴性对照。具体步骤如下：1）石蜡切片厚4μm，常规脱蜡，置于3%过氧化氢甲醇溶液中，封闭内源性过氧化物酶活性。2）蒸馏水冲洗，采用微波修复法进行抗原修复。3）PB S洗，加入正常山羊血清，37℃，30min，封闭内源性生物素；甩掉血清，加一抗。4）PB S冲洗，5min，3次；滴加二抗（均为生物素标记羊抗兔IgG），37 ℃，25min。5）PB S 冲洗，5min，3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素（SP），37℃，20min。6）PB S 冲洗，5min，4 次。7）用新鲜配制的 DAB-H2O2液显色，光镜下观察并控制显色程度；蒸馏水冲洗，终止显色。8）苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，光镜观察，阳性部位呈棕黄色。

免疫组化结果用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统分析3组大鼠CTGF的静态灰度值。CTGF的表达强度与测得的灰度值呈负相关。

1.4 统计学方法 所有数据用SPSS 19.0处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示。两组间比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析处理，P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

整个实验过程顺利，各组死亡大鼠：A组1只、B组1只、C组5只、D组3只、E组3只、F组2只。故至实验结束时各组实验大鼠数量为：A组（n=9）、B 组（n=13）、C 组（n=9）、D 组（n=11）、E 组（n=11）、F组（n=12）。各项实验结果分析如下。

2.1 各组大鼠血糖比较 实验结束时，各糖尿病大鼠（B、C、D、E、F 组）血糖比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 各组股动脉TGF-β1、CTGF表达水平 见表1。与正常对照组比较，糖尿病模型组CTGF、TGF-β1均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与正常对照组比较各治疗组，CTGF、TGF-β1均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；各中药治疗组与糖尿病模型组比较，CTGF、TGF-β1均降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）；与糖尿病模型组比较，西药组 CTGF、TGF-β1 均降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与西药组比较中药高剂量组，CTGF、TGF－β1均有降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠股动脉中CTGF、TGF-β1的表达水平（±s）Tab.1 Theexpression levelsof CTGF and TGF-β1 in arteria cruralisof rats in each group（±s）

表1 各组大鼠股动脉中CTGF、TGF-β1的表达水平（±s）Tab.1 Theexpression levelsof CTGF and TGF-β1 in arteria cruralisof rats in each group（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别 n CTGF TGF-β1正常对照组 9 1.45±0.16 12.47±2.83 DM 模型组 13 6.11±0.67** 43.25±3.16**加味方高剂量组 9 2.86±0.30*▲▲ 16.42±1.68*▲▲加味方中剂量组 11 3.14±0.12*▲ 24.74±2.53*▲加味方低剂量组 11 3.62±0.21*▲ 31.86±4.39*▲二甲双胍治疗组 12 3.29±0.30*▲ 28.75±4.55*▲

2.3 各组大鼠免疫组化图像观察及分析 CTGF：正常对照组大鼠胞浆有散在黄色物质，呈弱阳性改变；模型组血管黏膜下层细胞浆可见大量棕黄色物质表达呈强阳性反应，治疗组血管细胞CTGF表达都明显下降（P＜0.01），其中，中药高剂量组与西药对照组表达有差别，且差异有统计学意义。

TGF-β1：TGF-β1主要在胞浆中表达。正常对照组大鼠胞浆有散在黄色物质，呈弱阳性改变；模型组TGF-β1表达明显多的棕黄色颗粒物质，呈强阳性反应，治疗后，与造模组比较，中药组TGF-β1表达明显下降（P＜0.01），二甲双胍对 TGF-β1表达有影响，与中药中剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05），与中药高剂量组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

血管壁纤维化，作为糖尿病的主要并发症，表现在过量的细胞外基质的沉积导致血管管腔直径的缩小及动脉壁的增厚。研究发现TGF-β及其信号转导通路在血管纤维化中起着重要作用，并与CTGF有着密切联系。

TGF-β对于基质蛋白聚集和胶原纤维沉积具有重要调节作用，TGF-β在细胞外基质沉积过程中在减少基质降解酶及增加降解抑制剂合成的同时，还促进成纤维细胞增殖，在多种组织器官纤维化发展中起关键作用[1]。近年来，越来越多的研究已经提出以TGF-β1为靶目标抗纤维化。通过消除纤维化发展过程中病变组织产生的过多TGF-β1来预防或阻断纤维化的发展已成为纤维化防治研究的最新热点[2]。结缔组织生长因子是一种属于CCN家族的生长因子，是与组织纤维化密切相关的促纤维化细胞因子。正常生理情况下，其在维持正常细胞和结缔组织功能中具有至关重要的作用，它还在一些疾病引起的组织损伤修复及血管形成中起重要作用[3]。病理情况下，CTGF过度表达与某些增生性或纤维化疾病的发生发展密切相关[4]。研究表明，CTGF能够直接诱导结缔组织细胞增殖和细胞外基质（ECM）合成，是可以刺激成纤维细胞增殖和ECM沉积的生长因子[5]。CTGF生物学效应相对单一，多在TGF－β下游起作用，能特异性介导TGF-β1促细胞增殖、促进组织器官纤维化和ECM合成。CTGF是TGF-β1诱导组织纤维化的下游成分，CTGF启动子中包含了TGF-β1的反应元件（T RE/BCE-1），TGF-β1可促进CTGF表达上调[6]。CTGF与TGF-β共同作用能促进慢性纤维化，许多纤维化疾病都存在TGF-β与CTGF的高表达。CTGF能有效促进血管生成、细胞趋化及诱导细胞外基质生成，在多种组织细胞都有其表达，其中包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及成纤维细胞。有研究表明，CTGF可参与血管的损伤修复，可直接诱导结缔组织细胞增殖和细胞外基质合成，与血管纤维化密切相关[7]。

中医对糖尿病血管并发症病机的认识，主要是本虚标实论、从瘀论、从脾论和从肝论，最有代表性是本虚标实论和从瘀论[8]。王忆黎[9]认为本病的病机以标本虚实为主线，围绕虚、瘀、痰、毒4个环节。本虚主要有脾气虚、肾阴不足、脾肾两虚、甚至阴阳两虚，而瘀、痰、毒则是构成标实的基本要素。吴深涛[10]认为消渴病与其并发症实质上是由虚致实，又因实致虚的相对的因果关系。但大多认为本病气阴两虚为本，痰浊瘀血为标，互为因果恶性循环，致使糖尿病血管病变进行性发展加重。因此益气养阴、活血化瘀是治疗糖尿病血管并发症的常用大法。用于瘀热互结的经方桃核承气汤伍以益气养阴药而成的加味桃核承气汤既往有研究表明在防治糖尿病血管并发症上有很好的作用[11]。通过本研究证实其能有效降低致纤维化因子TGF-β1、CTGF在实验性糖尿病鼠大血管病变中的表达，其对DM大血管病变有改善作用，并存在剂量依赖关系。这为今后的研究以及防治糖尿病血管病变提供一条新途径。

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Expression of TGF-β1 and CTGF in ratswith experimentaldiabeticmacroangiopathy and intervention role of traditionalChinesemedicine

WANG Jun,XUYang,YUANXiang-ke,ZHANGXue-yong,DINGZhi-ming
（Th e FirstHospital Affiliated of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,Chi na）

[Objective]To explore the pathogenesismechanism ofmacroangiopathy in diabetic patients trough observing the expression of TGF-β1 and CTGF in ratswith experimental diabeticmacroangiopathy and decide the target in preventing and treating themacroangiopathy in patientswith diabetes through observing the preventing effectof TCM.[Methods]Among eightymale SD rats seventywere induced with diabetes(DM).They were divided into 5 groups:model group(n=14),high,medium and low dose of traditional Chinese medicine groups(n=14),melbine group(n=14).All rats in these six groupswere givingwith ordinary feed for12 weeks.After that,arteria cruraliswasobtained and the site and change ofexpression ofCTGFand TGF-β1 in which were observed.[Results]TGF-β1wasmainly expressed in the cytoplasm.It is strong positive inmodelgroup.In Chinesemedicine intervention groups the expression of TGF-β1 was declined obviously(P<0.01).Melbine has influence on the expression of TGF-β1,but the comparison with high dose of traditional Chinesemedicine group has significantdifference(P<0.05).A large ofbrown-1yellowmaterialwith strong positive reaction(CTGF)could be seen in cytochylema in submucosa ofblood vesselsofmodelgroup.But the CTGFexpressionwasallsignificantly lowered in cellofblood vessels in drug intervention groups(P<0.01).The difference ofexpression between high dose group and Westernmedicine controlgroup was statistically different.[Conclusion]1）The onsetofdiabetic angiopathymay be concerned with fibrosis.2）Modified Taohe Chengqi Decoction can reduce the expression of Fibrosis factor TGF-β1 and CTGF in ratswith experimentaldiabeticmacroangiopathy.Itcan improvemacroangiopathy in DM and hasa dose-1dependent relationship.

diabetesmellitus 2macroangiopathy;macroangiopathy fibrosis;traditionalChinesemedicine;CTGF;TGF-β1;immunohistochemistry

R587.2

A

1672-1519（2012）03-0266-04

天津市应用基础研究计划项目（09JCYBJC12500）。

王 军（1962-），女，博士，主任医师，教授，主要从事中医糖尿病足与周围血管病相关研究工作。

2012-04-22）