Smad4基因siRNA干扰对小鼠骨骼肌急性钝挫伤愈合的影响

李宏云 陈疾忤 陈世益 陈始秋 张庆国

复旦大学运动医学中心 复旦大学附属华山医院运动医学与关节镜外科（上海 200040）

骨骼肌损伤在运动医学中很常见，发病率约10%～55%[1]。 休息、冰敷、加压、制动、药物和康复锻炼等现有治疗方法，对于减少瘢痕形成、促进肌肉再生的作用有限[2]。严重损伤的骨骼肌常难以完全修复，在经过炎性阶段后，纤维组织与生肌组织同时增生，然而纤维组织增生的速度要比肌肉再生的速度快，最终导致瘢痕形成远多于有功能的再生肌肉。因此纤维化是肌肉再生修复过程中的一大障碍。损伤处瘢痕组织不具有肌肉的生物力学性能，造成其功能下降，容易再次受伤[3]。

TGF β作为一种促纤维化因子，有促进细胞外基质的形成，促进成纤维细胞合成胶原蛋白、纤维粘蛋白及蛋白多糖等细胞外基质，促进细胞外基质蛋白特异性表面膜受体表达的作用[4]。TGF β的纤维化作用主要通过TGF β－Smad信号通路调控。Smad4是该信号通路中一个重要的蛋白，其与不同Smad蛋白的协同作用是TGF β超家族信号转导途径中的关键环节，同时涉及Smad4下游调控或者交互对话信号通路，在整个信号转导的过程中发挥关键作用。本课题组成员之前的研究，已成功构建以慢病毒为载体的Smad4 siRNA，转染C2C12成肌细胞后，发现可抑制C2C12细胞的Smad4表达，并抑制成肌细胞纤维化过程[5]。本实验采用RNA干扰方法，利用慢病毒载体将Smad4的RNA干扰片断植入小鼠体内，了解其对在体骨骼肌纤维化抑制作用及对骨骼肌愈合能力的影响，以期其长期发挥抑制Smad4基因表达，降低Smad4蛋白分泌，阻断TGF β－Smad信号转导的作用，最终达到抑制骨骼肌纤维化，提高骨骼肌愈合质量的目的。如能达到研究目的，将对骨骼肌损伤的治疗提供又一种崭新的方法和手段。

1 材料与方法

1.1 实验动物

体重20～25 g雌性C57bl小鼠共60只，由中国科学院上海实验动物中心提供，许可证号：SCXK（沪）2009-0019。按国家标准啮齿类动物饲料饲养于复旦大学动物实验部。自由摄食饮水，动物房温度21～23℃，相对湿度 40%～60%。

1.2 骨骼肌钝挫伤模型建立

采用Kasemkijwattana等[2]的骨骼肌钝挫伤模型造成实验小鼠骨骼肌钝挫伤，打击前10%水合氯醛（0.3 ml/100g）腹腔注射麻醉，将小鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置上，采用重物高空垂直下落造成打击伤，损伤部位为小鼠右下肢腓肠肌内侧面中段。致伤物为一段固体木制圆柱体，打击面直径为0.8 cm，打击物质量为16.7 g，从1 m高空垂直下落。解剖证实打击致伤率100%。

1.3 动物分组

54只小鼠随机分成①PBS对照组、②Smad4 siRNA注射组、③scrambled siRNA注射组三组，每组18只。小鼠打击伤后10天，分别在三组损伤部位注射 PBS 0.1 ml、Smad4 siRNA （浓度 1×106ifu/μl）、scrambled siRNA（浓度 1×106ifu/μl）。 Smad4 siRNA是以慢病毒为载体的Smad4 siRNA，scrambled siRNA是作为对照的、以慢病毒为载体的乱序siRNA，由本课题组在之前的研究中构建成功[5]。于右后肢钝挫打击伤后第28天，脱颈处死各组小鼠后在腓肠肌损伤部位取材。完整取出右下肢腓肠肌后备用（用于生理学检测的小鼠取双下肢腓肠肌），其中6只用于免疫组化染色检测，6只用于Real Time-PCR和Western blot检测，6只用于生理学检测。另6只小鼠未进行骨骼肌打击伤，作为正常对照，用于生理学检测。

1.4 Real Time-PCR检测

按Trizol试剂盒（美国Invitation公司）说明书抽提RNA总量，按M-MLV、SYBR Premix Ex Taq试剂盒（日本Takara公司）说明书进行逆转录、扩增。βactin为内参。Smad4上游引物为5’-CGGCCGTGGCAGGGAACA-3’， 下游引物为 5’-CTGCAGAGCTCGGTGAAGGTGAAT-3’， 长度为 215bp；βactin上游引物为 5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游引物为5’-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3’，长度为 211 bp。PCR 反应体系 20 μl。 反应条件为 95℃、10 s，60℃、20 s，72℃、20 s，40 个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.5 Western blot检测

取出液氮保存的组织，使用无菌手术刀于干冰上切取100 mg大小，转移到1.5 ml无菌离心管，加入0.5 ml 4℃预冷的蛋白裂解液，使用电动匀浆器进行组织匀浆。SDS-PAGE电泳分离后转PVDF膜。将PVDF膜用5%脱脂奶粉（奶粉溶解于TBST中）封闭1 小时，加入一抗 Smad4（1∶500，美国 Santa Cruz公司）、GAPDH （1∶800， 美国 Cell Signaling 公司），用TBST稀释，4℃过夜。然后加入二抗 （1∶3000，美国Cell Signaling公司）在室温下反应2小时后，ECL发光法检测Smad4蛋白表达。

1.6 荧光检测

切取三组小鼠损伤部位的腓肠肌及Smad4 siRNA注射组小鼠的肝脏，OCT包埋，放入经液氮预冷的丙酮中，速冻1 min；将标本置于冰冻切片机上，以5 μm层厚切片，贴于涂APES的防滑载玻片上，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白 （Green Fluorescent Protein，GFP）在组织中的表达。

1.7 免疫组化检测

切取的腓肠肌标本在10%中性福尔马林中固定3 d后脱水，石蜡包埋，于腓肠肌中间部分纵行切片，厚15 μm，随后按masson染色试剂盒（厦门迈威生物科技有限公司）说明书操作进行Masson染色。免疫组化染色检测Vimentin表达 （Vimentin一抗稀释浓度1∶500，美国Sigma-Aldrich公司，二抗稀释浓度1∶1000，美国 Cell Signaling 公司）。 在 Nikon80i显微镜下观察，采用NIS-Elements BR2.30图像分析系统进行分析，每张切片在40倍镜随机观察5个视野，记录并比较三组小鼠染色阳性区域和免疫组化阳性值（阳性强度×阳性面积）差异。

1.8 生理学检测

鼠颈椎脱臼法处死后，立即仔细分离双侧下肢腓肠肌，自腱骨结合部切下，放入恒温水浴槽中，并浸泡于 Krebs液（NaCl 113、KCl 4.7、CaCl21.25、Mg-SO41.2、KH2PO41.2、NaHCO325.0、葡萄糖 11.5，单位mmol/L）中，一端固定于水浴槽底部，另外一端固定于张力传感器上，再将信号传输至生物信号采集处理系统仪器中。测试前标定力和位移的传感器，并将肌肉调整至最适初长度。初始张力调整为20 mN，平衡20 min后，电刺激腓肠肌，记录肌肉的快速颤搐收缩和强直收缩，并取其平均值。

为了减小个体差异及测试时间所造成的误差，将每只小鼠伤侧快速颤搐收缩及强直收缩数值与健侧的比值作为参数进行统计学比较。

1.9 统计学分析

使用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，多组之间采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异具有高度统计学意义。

2 结果

2.1 荧光显微镜下观察病毒在体转染骨骼肌的情况

伤后28天小鼠体内GFP表达：在Smad4 siRNA注射组和scrambled siRNA注射组小鼠腓肠肌注射病毒部位均检测到GFP荧光，但在PBS对照组小鼠骨骼肌内和Smad4 siRNA注射组小鼠肝脏组织内未检测到GFP荧光表达（见图1），表明除注射局部外，未发现远处脏器有目的基因表达，采用慢病毒载体局部注射转染目的基因安全、有效。

2.2 组织Smad4基因和蛋白表达

图2显示，Smad4siRNA注射组骨骼肌组织Smad4基因及蛋白表达明显低于scrambled siRNA注射组和PBS对照组，差异具有高度统计学意义（P<0.01），表明局部注射以慢病毒为载体的Smad4 siRNA能抑制损伤骨骼肌Smad4表达。

2.3 骨骼肌组织疤痕形成的情况

图3中，疤痕显示为蓝色，肌肉组织显示为红色。结果发现，Smad4 siRNA注射组疤痕明显少于对照组和scrambled siRNA注射组，差异具有高度统计学意义 （P<0.01），表明局部注射慢病毒介导的Smad4 siRNA可明显抑制骨骼肌损伤后的纤维化，减轻疤痕生成。

2.4 骨骼肌组织vimentin表达

图4显示，棕黄色为Vimentin阳性染色，反映纤维化的严重程度。Smad4 siRNA注射组vimentin明显少于对照组和scrambled siRNA注射组，差异具有高度统计学意义（P<0.01），表明局部注射慢病毒介导的Smad4 siRNA可抑制骨骼肌损伤后的纤维化，减轻疤痕生成。

2.5 生理学检测结果

图3 各组小鼠骨骼肌损伤愈合过程中的疤痕形成情况

图4 各组小鼠骨骼肌损伤愈合过程中的纤维化情况

图5显示，Smad4 siRNA注射组小鼠腓肠肌强直收缩和快速颤搐收缩明显高于PBS对照组和scramble siRNA注射组，差异具有统计学意义（P<0.05），表明Smad4 siRNA注射组骨骼肌损伤愈合质量优于PBS对照组和scramble siRNA注射组，局部注射慢病毒介导的Smad4-siRNA能有效促进小鼠骨骼肌损伤愈合。

图5 各组小鼠强直收缩和快速颤搐收缩测试结果

3 讨论

骨骼肌损伤后，损伤肌肉残端之间的空隙最初由血肿充填。血肿机化形成的纤维素交织形成基质，作为侵入的成纤维细胞支架。为了恢复结缔组织的完整性，成纤维细胞开始合成蛋白质和细胞外基质大分子。Ⅰ、Ⅲ型胶原及纤连蛋白的合成可以作为再生肌纤维的骨架，使再生肌纤维能与细胞外基质中的蛋白接触，在损伤间隙传导收缩力[6]。在肌肉严重损伤时，成纤维细胞迅速增殖导致瘢痕组织过度增生，形成机械性屏障，阻碍了损伤区域骨骼肌的再生，并易再发损伤，使病情反复迁延难愈。因此，早期应及时采用正确治疗手段，尽可能限制血肿范围，避免成纤维细胞过度增生以及瘢痕过度形成，影响愈合质量。

在骨骼肌损伤愈合过程中，TGF β-Smad信号通路对纤维化的调控作用非常重要。直接在小鼠损伤骨骼肌部位注射外源性IFN-γ，能够抑制骨骼肌纤维化，提高愈合质量[7，8]。IFN-γ 可引起 TGF β－Smad信号通路中的抑制型蛋白Smad7表达升高，通过Smad7阻断该信号通路向下传导，从而抑制TGF β的作用[9]。直接在小鼠骨骼肌损伤部位注射能够抑制TGF β与受体结合的药物，也可抑制骨骼肌纤维化的发生，提高骨骼肌损伤修复的质量[10，11]。 此外，在心肌、皮肤、肾脏、肺等多种组织中均发现TGF β－Smad信号通路与纤维化关系非常密切[12-14]。

Smad蛋白家族成员作为TGF β下游的受体激酶，在TGF β信号通路中发挥着重要的介导作用。迄今为止，哺乳动物中发现了8种不同的Smads家族成员。根据他们的结构和功能不同，Smads被分为3 个亚族：（1）受体激活的 Smads（R-Smads），包括Smad1、2、3、5、8， 它们可与 TGF β 受体直接作用并磷酸化，之后再与Smad4结合为二聚体转位入核；（2）通用型Smad（Co-Smad），目前在人类仅发现Smad4，是所有R-Smads的结合配体，并促进RSmads转移入细胞核，可与Smads家族其他成员相互作用形成稳定的异源多聚体，转位入核后调节靶基因转录；（3）抑制型 Smads（I-Smads），包括 Smad6、7，为TGF β-Smad信号转导通路的负向调节因子，可与R-Smads竞争性结合受体，阻止R-Smads磷酸化，从而阻断TGF β的生物学效应。Smad4是该条信号通路中极重要的一个蛋白，它与不同的Smad蛋白的协同作用是TGF β超家族信号转导途径中的关键环节，同时涉及Smad4下游调控或者交互对话信号通路，在整个信号转导过程中发挥关键作用[15，16]。

RNA干扰（RNAi）是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。RNAi与传统基因治疗方法相比具有诸多优势：其基因沉默效能极强，具有很高的序列特异性，作用效果可在细胞间持久传递，且能够通过去除载体的方法终止其基因沉默的效果[17，18]。

慢病毒作为目前转染效率最高的基因治疗载体，其最大的优势在于能够将基因整合至靶细胞基因组，获得更稳定持久的表达。早期研究中最常见的是静脉注射，由于其便捷有效得到了广泛应用。但全身性用药使大部分siRNA被非靶向组织摄取，这些组织中靶基因的沉默将不可避免地引起严重副作用。另一方面，静脉注射的转染效率也受到影响，需要增大病毒液用量。Wolf[19]研究发现，将质粒DNA直接注射到心肌和骨骼肌，可获得外源DNA表达，证实了原位转染的可行性，同时也为外源性基因转染组织提供了新途径。近年来，出现了一些慢病毒局部注射的方法，包括玻璃体内、小脑内、鼻内、关节内等[20-24]，以期减轻静脉注射的毒副作用，同时提高病毒转染效率。以往研究发现，局部注射可避免全身其他组织及血液中靶基因的沉默效应[23，24]。本研究也发现，将慢病毒液直接注射至小鼠损伤骨骼肌局部，未发现报告基因GFP在体内其他组织表达，也未发现其他组织Smad4基因及蛋白表达受到抑制。这表明采用慢病毒局部注射方法能够成功将目的基因转染小鼠损伤局部的骨骼肌细胞，并可长期抑制Smad4基因及蛋白表达，而不会远处转染其他脏器，是一种安全有效的方法。

基因治疗中更为重要的是转基因产物表达时间的长短，表达时间太短则不能达到基因治疗的目的。Kyosen等[25]将慢病毒液通过静脉注射的方法注射至小鼠体内，注射后24周时在骨骼肌及心肌组织内仍能检测到转基因产物的表达。慢病毒局部直接注射后也能长时间表达转基因产物。Jeon等[26]采用直接注射方法将慢病毒液直接注射至大鼠骨骼肌，注射后2个月仍能检测到转基因产物的表达。本研究将RNAi技术与慢病毒载体结合，单次局部注射慢病毒介导的siRNA后，直至小鼠骨骼肌伤后4周仍能发现报告基因GFP在注射部位的稳定表达，且注射局部的Smad4基因和蛋白水平表达降低，证实慢病毒载体将靶向Smad4 siRNA整合至骨骼肌细胞内，可长时期稳定发挥RNAi的干扰作用，其作用时效远远高于传统单次给药或瞬时转染，有助于治疗大面积严重骨骼肌损伤。另外，骨骼肌损伤修复是一个漫长的过程，稳定持久的基因沉默效果有助于降低用药频率，减少全身性副反应。

波形蛋白（Vimentin）是间质细胞中最主要的中间纤维，存在于中胚层起源的细胞中，如成纤维细胞、内皮细胞、粒细胞、系膜细胞。中间纤维是真核生物细胞的重要结构性特征，它们与微管及肌动蛋白微细丝，组成细胞骨架。TGF β可促进波形蛋白的表达上调[27]。尽管大多数中间纤维结构相对稳定，但在成纤维细胞中波形蛋白以一种动态结构存在。正常情况下，骨骼肌细胞仅表达微量的波形蛋白，在炎症、损伤等各种因素的刺激下，间质成纤维细胞发生功能与表型变化，转分化为成纤维细胞和具有细胞特性的肌成纤维细胞，大量表达波形蛋白。因此许多学者将波形蛋白作为骨骼肌损伤后纤维化程度的指标[7，10，11]，波形蛋白表达越高，意味着骨骼肌损伤后纤维化程度越严重。本研究发现，Smad4 siRNA注射组波形蛋白表达较对照组明显降低，Masson染色结果也提示，Smad4 siRNA注射后疤痕生成弱于对照组。这表明Smad4 siRNA可明显降低骨骼肌急性钝挫伤后的纤维化，减少疤痕产生。

另外，生理学检测发现，急性钝挫伤后28天，Smad4 siRNA注射组小鼠腓肠肌强直收缩和快速颤搐收缩明显高于对照组，表明抑制骨骼肌急性钝挫伤后的纤维化，减少疤痕生成后，可明显改善骨骼肌的愈合质量。

骨骼肌损伤后的再生和纤维化发生的时间不同。一般来说，伤后14天骨骼肌再生达到高峰。伤后10～14天纤维化反应开始启动，伤后18天反应最明显，并一直持续到伤后4周[28]。以往研究常在伤后1～2 周时注射抑制骨骼肌纤维化的药物[29，30]。综上考虑，我们于伤后第10天在损伤局部注射慢病毒液，以期避免由于病毒注射而对骨骼肌再生造成影响，而且精确调控其对纤维化的抑制作用。

4 总结

以慢病毒为载体的Smad4 siRNA可成功转染小鼠急性钝挫伤骨骼肌，并长期发挥抑制Smad4基因及蛋白表达的作用，同时不会远处转染其他脏器，是一种安全有效的方法。同时，以慢病毒为载体的Smad 4 siRNA可抑制骨骼肌损伤后纤维化，减轻疤痕生成，改善骨骼肌损伤后的愈合质量，促进骨骼肌损伤修复。

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