螺内酯对急性心肌梗死心肌细胞凋亡相关基因Bcl-2mRNA及BaxmRNA表达影响

2012-05-08许香梅任晓敏刘曙光刘海云王晓燕董士民

河北医科大学学报 2012年4期

许香梅，任晓敏，刘曙光，刘海云，王晓燕，董士民

（1.河北省石家庄市第一医院心内科，河北石家庄，050011；2.河北省石家庄市供水医院内科，河北石家庄，050021；3.河北省石家庄市桥东区休门卫生院内科，河北石家庄，050011；4.河北医科大学第三医院急诊科，河北石家庄，050051）

许香梅1，任晓敏1，刘曙光2，刘海云3，王晓燕1，董士民4

目的研究醛固酮受体拮抗剂螺内酯对心肌细胞凋亡相关基因Bc1-2mRNA及BaxmRNA表达的作用。方法结扎左冠状动脉前降支制造大鼠左心室大面积心肌梗死模型。术后存活大鼠共72只，随机分为心肌梗死（acute myocardia1 infarction，AMI）对照组（AMI组）、螺内酯（spirono1actone，Spi）治疗组（Spi组）及假手术组（Sham组），每组24只。分别于术后48h，7、14、21d用PCR方法测定非梗死区心肌细胞Bc1-2mRNA和BaxmRNA的表达。结果与Sham组相比较，AMI组和Spi组大鼠非梗死区心肌细胞Bc1-2表达在48h，7、14、21d显著降低（P＜0.01），BaxmRNA表达均显著升高（P＜0.01）；与AMI组比较，Spi组大鼠非梗死区心肌细胞Bc1-2和BaxmRNA基因表达在48h、7d差异无统计学意义（P＞0.05），14、21d时心肌细胞BCL-2基因表达均升高（P＜0.05和P＜0.01），BaxmRNA基因表达均显著降低（P＜0.05和P＜0.01）。结论螺内酯可增加急性心肌梗死后大鼠非梗死区心肌细胞凋亡相关基因Bc1-2mRNA的表达和减弱BaxmRNA的表达。

心肌梗死；细胞凋亡；螺内酯

细胞凋亡是一种受多种基因调控的细胞自身程序性死亡［1］。研究［2-3］发现，心肌细胞凋亡是引起急性心肌梗死后心室重构的重要因素。长期大剂量使用血管紧张素转换酶抑制剂治疗产生所谓的“醛固酮逃逸现象”。因而醛固酮受体拮抗剂在心室重构中具有不可替代的作用。醛固酮受体拮抗剂可使心肌纤维化程度减轻，心肌顺应性改善，心室肥厚逆转。鉴于醛固酮对心室重构的影响，本课题通过急性心肌梗死（acute myocardia1 infarction，AMI）大鼠模型，探讨醛固酮受体拮抗剂影响AMI后心室重构的细胞学机制。

1 材料与方法

1.1 大鼠AMI模型制作：结扎左冠状动脉前降支制造大鼠左心室大面积AMI模型。大鼠称质量，经

3%戊巴比妥钠麻醉（40mg/kg腹腔内注射），并给予阿托品0.1mg/kg腹腔注射。作气管插管，接小动物呼吸机（江西省特力麻醉呼吸设备公司生产）。取前胸正中切口，在3～4肋间进入胸腔，分离心包，从剑突下向胸腔方向及从两侧胸壁后方向上方适度挤压，使心脏跳出胸腔，在右心室流出道与左心房之间，距主动脉根部2～3mm处用丝线（7-0）穿过左冠状动脉前降支，在心肌梗死组连同一小束心肌一起结扎，以心脏表面颜色即刻变化，术后心电图J点抬高判断造模成功。然后逐层关胸。撤掉呼吸机，自主呼吸平稳后，拔出气管插管，逐层缝合。假手术组（Sham组）只穿线绕过冠状动脉前降支而不结扎。术后大鼠保温，单笼放置，待清醒后再次称质量，编号，按组分笼饲养。

1.2 分组和给药方法：将术后48h存活的大鼠72只随机分为Sham组、AMI对照组（AMI组，生理盐水2mL·d-1灌胃）和螺内酯（spirono1actone，Spi）治疗组（Spi组，螺内酯20mg·kg-1·d-1灌胃）。每组24只。

1.3 取材：3组分别于术后的48h，7、14、21d取材，用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，迅速开胸，取出心脏，冰上操作，4℃经高压处理的DEPC水中洗去残余血液，剪取左心室非梗死区心肌组织约100mg，立即液氮速冻后，于-80℃中保存，用于RT-PCR检测。

1.4 观察指标：用RT-PCR方法检测大鼠非梗死区心肌组织Bc1-2mRNA和BaxmRNA表达，目的基因引物的合成，引物序列依据文献报道设计，由上海生物工程公司合成。大鼠Bc1-2引物序列上游引物，5’-CAA GAA TGC AAA GCA CAT CC-3’，编号T12258，下游引物，5’-ATC CCA GCC TCCGTT ATC C-3’，编号T12259，PCR产物为702bp。大鼠Bax引物序列上游引物，5’-GGC TGG CAA GGC CTG GT-3’，编号T12057，下游引物，5’-AGC CAC AAA GAT GGT CAC TGT CT-3’编号T12058，PCR产物407bp。大鼠β-actin引物序列上游5’-GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA-3’，下游5’-GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG-3’，选自391～756bp，长为375个bp。提取大鼠心肌组织总RNA，并进行完整性检测。合成cDNA第一链，目的基因的PCR扩增，用凝胶图像分析系统（Ge1-Pro Ana1yzer Version 3.0）分析结果。

1.5 统计学方法：应用SPSS13.3软件包进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 螺内酯对大鼠非梗死区心肌细胞 Bc1-2mRNA、BaxmRNA表达的影响：与Sham组相比较，AMI组和 Spi组大鼠非梗死区心肌细胞 Bc1-2 mRNA表达在 48h，7、14、21d均显著降低（P＜0.01），Bax mRNA表达在48h，7、14、21d均显著升高（P＜0.01）。与AMI组相比较，Spi组大鼠非梗死区心肌细胞Bc1-2mRNA表达在48h、7d差异无统计学意义（P＞0.05），14、21d均有所升高，分别升高15%（P＜0.05）、29%（P＜0.01）；BaxmRNA表达在48h、7d差异无统计学意义（P＞0.05），14、21d均有所降低，分别降低8%（P＜0.05）、30%（P＜0.01）。见表1，2。

表1 各组非梗死区心肌组织Bcl-2mRNA表达的变化（n=24，±s）

*P＜0.01与Sham组比较 #P＜0.05 △P＜0.01与AMI组比较（q检验）

Bc1-2mRNA组别48h 7d 14d 21d Sham组0.77±0.04 0.76±0.04 0.77±0.02 0.79±0.02 AMI组 0.28±0.02* 0.30±0.06* 0.47±0.06* 0.52±0.04*Spi组 0.29±0.02* 0.32±0.05* 0.54±0.04*# 0.67±0.06*△

表2 各组非梗死区心肌组织BaxmRNA表达的变化（n=24，±s）

*P＜0.01与Sham组比较 #P＜0.05 △P＜0.01与AMI组比较（q检验）

BaxmRNA 组别48h 7d 14d 21d Sham组0.30±0.03 0.28±0.03 0.30±0.02 0.30±0.02 AMI组 0.89±0.04* 0.88±0.06* 0.69±0.03* 0.60±0.02*Spi组 0.90±0.05* 0.81±0.07* 0.64±0.04*# 0.42±0.05*△

3 讨论

3.1 AMI后心肌细胞凋亡相关基因Bc1-2mRNA和BaxmRNA表达的变化：研究［2］表明，心肌细胞凋亡是使心肌梗死范围扩大的一个独立因素。而细胞凋亡受多种基因、蛋白质、生长因子的调控，Bc1-2家族是目前研究最深入的调控因子之一。Bc1-2家族的成员能将准确地感受细胞所受到的刺激信号并整合，从而决定细胞是否凋亡［3］。本研究显示，大鼠 AMI后在AMI组48h，7、14、21d非梗死区Bc1-2mRNA表达明显降低，BaxmRNA表达明显增加。表明在AMI后心肌细胞凋亡中Bc1-2家族起重要作用。可能机制为Bc1-2基因通过防止受损的DNA激活凋亡的诱导基因来防止细胞凋亡［4］。有研究［5］认为，Bc1-2家族的Bax同源二聚体导致线粒体Ca2+内流及细胞色素C外流的PTT交换通道，引起细胞凋亡。Bc1-2也可与Bax结合，Bax表达水平增加可拮抗Bc1-2的作用，促进细胞凋亡。Bc1-2也可能通过抗氧化作用或抑制氧自由基的产生抑制细胞凋亡。也有研究［6］认为Bc1-2基因是通过细胞内二磷酸鸟苷含量增加而实现抗凋亡的。Bc1-2与Bax调节细胞凋亡不仅取决于自表达的高低，而且还与Bc1-2/Bax比值有关，当比值减小时促进细胞凋亡，反之抑制细胞凋亡。

3.2 螺内酯对大鼠AMI后心肌细胞凋亡相关基因Bc1-2和Bax表达的影响：本研究显示，Spi组与AMI组相比，随时间的延长Bc1-2基因表达逐渐增加，Bax基因表达逐渐减低，提示螺内酯可能通过增加Bc1-2基因表达，减弱Bax基因表达，而抑制心肌细胞凋亡。本文通过从细胞凋亡相关基因表达来阐明其对心室重构的有益作用。螺内酯可减低Bax基因表达，增加Bc1-2基因表达，抑制心肌细胞凋亡，改善心室重构。可能机制为，降低醛固酮水平，减轻醛固酮所致的心室重构作用，醛固酮有不依赖血管紧张素Ⅱ的独立作用，尤其是可以改善心室重构和血管重塑［7］；减低了血浆和心脏局部的醛固酮水平，从而减弱血管紧张素Ⅱ的效应，醛固酮受体拮抗剂通过降低心脏局部醛固酮水平下调AT1受体密度减弱血管紧张素Ⅱ的效应，从而减弱AngⅡ与AT1受体结合，通过激活三磷酸肌酸途径减弱cfos、c-jun、c-myc等转录因子的表达，抑制心肌细胞凋亡，并降低由此介导的Bax基因表达水平，同时增加Bc1-2基因表达；减轻氧化应激，螺内酯通过减弱AMI后氧化应激，抑制应激活化蛋白激酶JNK（JNK是丝裂素活化蛋白酶家族主要成员之一）途径引起细胞凋亡和Bc1-2基因表达减弱，使Bc1-2基因表达增加抑制细胞凋亡；抑制某些细胞因子表达，醛固酮受体拮抗剂通过抑制某些细胞因子（如肿瘤坏死因子-α［8］、转化生长因子-β）表达而抑制细胞凋亡并增加Bc1-2表达，醛固酮受体拮抗剂通过减轻容量负荷而增加Bc1-2表达、降低Bax表达，抑制心肌细胞凋亡；螺内酯可减轻心肌损伤边缘部位尚存心肌细胞早期凋亡，可能是通过改善心肌细胞线粒体功能，从而抑制细胞凋亡［9］。

大鼠AMI死后，非梗死区心肌细胞发生了凋亡，同时伴有凋亡相关基因Bc1-2的低表达及Bax的高表达；螺内酯治疗可增加AMI后大鼠非梗死区心肌细胞凋亡相关基因Bc1-2的表达和减弱Bax的表达，从而减少心肌细胞凋亡，进一步抑制心室重构。

［1］ AGAH R，KIRSHENBAUM LA，ABDELLATIF M，et a1.Adenotra1 of E2F21 directs ce11 cyc1e reetry and P53-indep endent apoptosis in postmitotic adu1t myocardium in vivo［J］.J C1in Invest，1997，100（11）：2722-2728.

［2］ KAJSTURA J，CHENG W，REISS K，et a1.Apoptotic and necrotic myocyte ce11 deaths are independent contributing variab1es of infarct size in rats［J］.Lab Invest，1996，74（1）：86-107.

［3］ CHENG W，KAJSTURA J，NITAHARA JA，et a1.Programmed myocyte ce11 death affects the viab1e myocardium after infarction in rats［J］.Exp Ce11 Res，1996，226（2）：316-327.

［4］ MISAO J，HAYAKAWA Y，OHNO M，et a1.Expression of Bc1-2 protein，an inhibitor of apoptosis，and Bax，an acce1erator of apoptosis，inventricu1ar myocytes of human hearts with myocardia1 infarction［J］.Circu1ation，1996，94（7）：1506-1512.

［5］ DANIAL NN，GRAMM CF，SCORRANO L，et a1.BAD and g1uco-kinase reside in amitochondria1 comp1ex that integrates g1yco1ysis and apoptosis［J］.Nature，2003，424（6951）：952-956.

［6］成玲俐，马虹，马中富，等.急性心肌梗死心肌细胞中Bax和Bc122基因的mRNA表达量及其与凋亡的关系［J］.临床心血管病杂志，2002，18（9）：1001-1439.

［7］ HAYASHI M，TSUTAMOTO T，WADA A，et a1.Re1ationship between transcardiac extraction of a1dosterone and 1eft ventricu1ar remode1ing：extracting a1dosterone through the heart promotes ventricu1ar remode1ing afteracute myocardia1 infarction［J］.J Am Co11 Cardio1，2001，38（5）：1375.

［8］ KROWN KA，PAGE MT，NGUYEN C，et a1.Tumor necrosis factor a1pha-induced apoptosis in cardiac myocytes.Invo1vement of the sphingo1ipid signa1ing Cascade in cardiac ce11 death［J］.J C1in Invest，1996，98（12）：2854-2865.

［9］赵文萍，张增祥，刘刚，等.螺内酯联合ACE抑制剂等药物长时间干预对大鼠心肌损伤后凋亡及其超微结构的影响［J］.医学教育与研究，2009，26（1）：1-4.

（本文编辑：刘斯静）

R542.22

1007-3205（2012）04-0431-03

2012-01-17；

2012-02-28

许香梅（1975-），女，河北大名人，河北石家庄市第一医院主治医师，医学硕士，从事心血管内科疾病诊治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.04.021