枯草芽孢杆菌工程菌产耐酸性高温α-淀粉酶发酵条件的优化

胡 博，刘逸寒，徐艳静，薄嘉鑫，路福平

(工业发酵微生物教育部重点实验室；天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

α-淀粉酶作为淀粉酶的一种，是目前最重要、最古老、应用范围最广的工业酶制剂之一，其中耐高温α-淀粉酶凭借其热稳定上的优势已经占据了很大的市场[1]．耐高温α-淀粉酶目前被广泛地应用于味精、啤酒、有机酸、酒精等食品发酵以及淀粉工业[2-3]．目前，国内外市场中常用的耐高温α–淀粉酶的最适 pH范围为 6～7[4]，在酸性条件下酶活明显降低，甚至失去活性，已经不能满足酸性条件下淀粉原料深加工工艺的要求，因此对耐酸性α-淀粉酶的需求日益上升．近几年来国内开展了大量的针对产耐酸性α-淀粉酶菌株发酵条件优化的研究，王淑军等[5]对 1株产耐热酸性α-淀粉酶的超嗜热古菌进行了发酵条件的优化，经优化后α-淀粉酶活力达到了 500,U/mg；刘雅琴等[6]在筛选出的耐酸性α-淀粉酶产生菌的基础上对其进行发酵培养基与发酵条件的优化，最终α-淀粉酶活力达到 31.4,U/mL，比初始时提高了 0.65倍；莫新迎等[7]通过单因素实验和响应面分析法对 1株产耐酸性α-淀粉酶的小孢根霉菌培养基组分进行优化，α-淀粉酶活力较优化前提高了 0.15倍，达到259.902,U/g干物质，但其酶活力均不高．

本实验通过对本课题组前期研究获得的可高效表达耐酸性高温α-淀粉酶枯草芽孢杆菌工程菌株pWB-amyd/WB600[8-10]发酵条件进行优化，旨在提高耐酸性高温α-淀粉酶活力，为以淀粉为原料的深加工工业的发展提供有力支撑．

1 材料与方法

1.1 菌株

产耐酸性高温α-淀粉酶工程菌株 pWB-amyd/WB600，由本实验室构建[9]并保藏．以初始发酵培养基及未优化的发酵条件进行发酵培养，初始酶活力为1,890,U/mL．

1.2 培养基

斜面培养基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，琼脂粉 20，卡那霉素 0.03，pH 自然．

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，卡那霉素 0.03，pH 自然．

初始发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，pH 自然．

1.3 培养方法

种子的培养：取冻存于–70,℃的工程菌株 pWB-amyd/WB600，将其接种到新鲜斜面培养基，37,℃培养 18,h后，挑取单菌落接入种子培养基，37,℃、200,r/min摇床培养16,h，得到种子液．

初始发酵培养：以 1%接种量接种至装液量50,mL发酵培养基的 250,mL三角瓶中，在 37,℃、160,r/min培养36,h．

1.4 生长曲线的绘制

配制 400,mL发酵培养基分装至 250,mL三角瓶，编号为 1—8，每瓶装液量 50,mL，121,℃灭菌20,min，待用．从新鲜斜面培养基挑取单菌落接入含有发酵培养基的三角瓶中，于 37,℃、200,r/min摇床振荡培养．每隔一定时间取样．将菌液适当稀释至吸光度在0.1～1.0范围内，用分光光度计于光程1,cm、波长 600,nm条件下测定其吸光度．以时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制重组菌生长曲线．

1.5 发酵培养基优化

1.5.1 碳源的选择

选择 10,g/L的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、玉米粉、薯干粉作为碳源，氮源为10,g/L的蛋白胨，比较不同碳源对产酶的影响，确定最适碳源．再以10,g/L的蛋白胨为氮源，加入10、20、30、40、50,g/L的最适碳源，确定最适碳源的最优质量浓度．

1.5.2 氮源的选择

以最适质量浓度的最适碳源为培养基基本组分，分别加入 10,g/L的胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、NH4NO3、NH4Cl，比较不同氮源对产酶的影响，确定最适氮源．再以最适质量浓度的最适碳源为培养基基本组分，加入 10、20、30、40、50,g/L 的最适氮源，确定最适氮源的最优质量浓度．

1.5.3 金属离子Ca2+对产酶的影响

以最优质量浓度的最适碳源、氮源为培养基基本组分，加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,g/L 的 Ca2+进行发酵，确定Ca2+的最优质量浓度．

1.5.4 Na2HPO4对产酶的影响

以最优浓度的最适碳源、氮源、Ca2+为培养基基本组分，加入 0、4、8、12、16,g/L 的 Na2HPO4进行发酵，确定Na2HPO4的最优质量浓度．

1.5.5 正交实验

利用 L9(34)正交实验筛选出玉米粉、蛋白胨、CaCl2和Na2HPO4的最佳配比．

1.6 发酵条件优化

1.6.1 培养基初始pH对产酶的影响

以上述优化后的培养基配方为基础，用一定浓度的 NaOH或 HCl溶液调节培养基初始 pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 进行发酵，确定培养基最适初始pH．

1.6.2 接种量对产酶的影响

以原始发酵培养条件为基础，分别按 1%、2%、3%、4%和 5%的接种量接种到优化后的最优培养基中，在 37,℃、160,r/min培养 36,h，取样测定酶活力，确定最适接种量．

1.6.3 装液量对产酶的影响

按优化后所得的最适接种量将种子液分别接种于装有 20、30、40、50、60、70,mL 发酵培养基的250,mL三角瓶中，在 37,℃、160,r/min培养 36,h，取样测定酶活力，确定最适装液量．

1.6.4 摇床转速对产酶的影响

将种子液接种到发酵培养基中，接种量和装液量均按照优化后的结果，在 37,℃条件下，摇床转速分别为 120、160、200、240,r/min 培养 36,h，取样测定酶活力，确定最适摇床转速．

1.6.5 发酵温度对产酶的影响

将种子液接种到发酵培养基中，接种量、装液量及摇床转速均按照优化后的结果，在27、32、37、42,℃分别培养36,h，取样测定酶活力，确定最适发酵温度．

1.7 酶活检测

参照QB/T 2306—1997[11]．酶活力单位定义：在70,℃、pH 6.0条件下，1,min液化1,mg可溶性淀粉成为糊精所需要的酶量，即为 1个酶活力单位，以U/mL表示．

式中：X，样品的酶活力(U/mL)；c，测试的酶液浓度(U/mL)；n，样品的稀释倍数；16.67，换算常数．

2 结果与分析

2.1 生长曲线的测定

工程菌株pWB-amyd/WB600生长曲线如图1所示．由图 1可知，0～12,h为生长的延滞期；12～18,h为对数生长期；从18,h开始进入稳定期．由于在对数生长中后期，菌体量较大，此时菌体还未发生自溶，因此确定在接种后18,h时收集菌体．

图1 工程菌株pWB-amyd/WB600生长曲线Fig.1 Growth curve of pWB-amyd/WB600

2.2 发酵培养基的优化

2.2.1 碳源对产酶的影响

初始发酵培养基中无特定的碳源，胰蛋白胨和酵母提取物仅能维持菌体生长至A600为3.0左右[12]，为了考察重组菌株对碳源的利用情况，本实验选择了几种常用的碳源进行碳源的优化．由表 1结果可知，玉米粉是产酶的最佳碳源，耐酸性高温α-淀粉酶活力达到最高值，为 2,090,U/mL，其余依次为可溶性淀粉、糊精、薯干粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖．玉米粉的最优质量浓度实验结果表明，随着玉米粉质量浓度的增加，耐酸性高温α-淀粉酶活力也随之增加，当玉米粉质量浓度为 20,g/L时，耐酸性高温α-淀粉酶活力达到最高，为 2,310,U/mL．当继续加大玉米粉质量浓度时，其耐酸性高温α-淀粉酶活力不再随玉米粉质量浓度的增加而增加，反而随之下降，所以本实验选取20,g/L为玉米粉的最适质量浓度．

表1 碳源对产酶的影响Tab.1 Effects of carbon resource on the yield of enzyme

2.2.2 氮源对产酶的影响

为了考察重组菌株对碳源的利用情况，实验中同时对有机氮源和无机氮源进行研究，选择 10,g/L的胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆、尿素、NH4NO3、NH4Cl作为氮源，碳源为20,g/L的玉米粉，其他条件相同，结果见表2．

表2 氮源对产酶的影响Tab.2 Effects of nitrogen resource on the yield of enzyme

由表 2可知，重组菌株利用以上氮源培养时，有机氮源对产酶的促进作用明显优于无机氮源．单一的无机氮源作为培养基中的氮源，菌体生长缓慢，产酶量较低．而有机氮源中，蛋白胨是最佳的氮源，其主要成分是各种氨基酸、肽类等可溶性氮化合物，耐酸性高温α-淀粉酶活力达到最高值，为2,310,U/mL．蛋白胨最优浓度实验结果表明，随着蛋白胨浓度的增加，耐酸性高温α-淀粉酶活力也随之增加，当蛋白胨质量浓度为 30,g/L时，耐酸性高温α-淀粉酶活力达到最高，为2,620,U/mL．所以本实验选取30,g/L为蛋白胨最适质量浓度．

2.2.3 金属离子Ca2+质量浓度对产酶的影响

根据 Machius等[13]的研究可知，Ca2+的添加对产地衣芽孢杆菌α-淀粉酶有明显的促进作用，这是因为产地衣芽孢杆菌α-淀粉酶是一种金属酶，金属离子Ca2+与之结合，有利于保持α-淀粉酶的结构稳定性及其活力．故选用不同质量浓度的 Ca2+进行发酵，由图2中可以看出，随着Ca2+质量浓度的增加，耐酸性高温α-淀粉酶活力也随之增加，当 Ca2+质量浓度为 0.6,g/L时，耐酸性高温α-淀粉酶活力达到最高，为2,740,U/ mL．当继续加大Ca2+质量浓度时，其耐酸性高温α-淀粉酶活力不再随Ca2+质量浓度的增加而增加，反而随之下降，所以本实验选取0.6,g/L为Ca2+最适质量浓度．

图2 CaCl2质量浓度对产酶的影响Fig.2 Effects of CaCl2concentration on the yield of enzyme

2.2.4 磷酸盐质量浓度对产酶的影响

磷酸盐对微生物产酶的作用是非常重要的，磷是细胞合成核酸必需的一种元素，也是加快吸收葡萄糖，促进细胞生长不可或缺的一种物质．所以耐酸性高温α-淀粉酶活力随着磷酸盐质量浓度的增加而增加，当磷酸盐浓度为8,g/L时，耐酸性高温α-淀粉酶活力达到最高，为 2,870,U/mL．但是随着磷酸盐质量浓度的继续升高，耐酸性高温α-淀粉酶活力却随之下降，所以本实验选取 8,g/L为磷酸盐最适质量浓度(图 3)．

图3 磷酸盐质量浓度对产酶的影响Fig.3 Effects of Na2HPO4 concentration on the yield of enzyme

2.2.5 正交实验

利用 L9(34)正交实验筛选出玉米粉、蛋白胨、CaCl2和Na2HPO4的最佳配比，结果见表3．

表3 培养基配方正交实验结果及其极差分析Tab.3 Results and variance analysis of orthogonal experiment of medium components

由表 3可知，在玉米粉、蛋白胨、CaCl2和Na2HPO4这4种培养基组分的不同配比中，耐酸性高温α-淀粉酶活力最高的组合为(g/L)：玉米粉 20，蛋白胨 30，CaCl20.5，Na2HPO48．极差分析结果表明4个因素的影响程度依次为：玉米粉＞蛋白胨＞Na2HPO4＞CaCl2．

由于从理论上优化得到的培养基不在正交实验表中，经验证实验结果表明，耐酸性高温α-淀粉酶活力达到 3,280,U/mL，此活力大于正交实验中出现的所有结果，验证了选取该结果的正确性．因此，确定最适发酵培养基配方为(g/L)：玉米粉 20，蛋白胨30，CaCl20.5，Na2HPO48．

2.3 发酵条件

2.3.1 培养基初始pH对产酶的影响

pH是影响微生物正常生理活动的一个重要因素．由图4结果显示，发酵培养基初始pH在5.0～8.0之间，都可产生耐酸性高温α-淀粉酶，初始pH为6.5时，即发酵培养基自然 pH，耐酸性高温α-淀粉酶活力最高，达到3,280,U/mL．所以本实验选取pH,6.5为最适初始pH．

图4 初始pH对产酶的影响Fig.4 Effects of pH on the yeild of enzyme

2.3.2 接种量对产酶的影响

由图 5结果显示，在接种量为 1%时，由于菌体数量过低，减少了蛋白质分泌总量，因此酶活力较低．当以 2%的接种量进行发酵培养时，菌体蛋白分泌较高，酶活力显著提高，耐酸性高温α-淀粉酶活力最高，达到 3,450,U/mL．随着接种量继续增加，耐酸性高温α-淀粉酶活力却随之下降．根据余晓红等[14]的研究可知，这是由于培养基中菌体相对密度增大，导致菌体生长时所需培养基成分不足同时溶氧不足，菌体生长状态不良，反而使酶活力降低造成的，所以本实验选取2%为最适接种量．

图5 接种量对产酶的影响Fig.5 Effects of inoculation volume on the yield of enzyme

2.3.3 装液量对产酶的影响

在微生物发酵过程中，能够提供充足的氧分对于提高产酶量具有重要的作用，在一定范围内，装液量越低，产酶量越高．由图 6结果显示，装液量在30,mL以上时，随着装液量的增加，发酵过程中溶氧量不足，菌体生长受到抑制，导致耐酸性高温α-淀粉酶活力下降．当装液量为30,mL时，耐酸性高温α-淀粉酶活力达到最高，为 3,670,U/mL．装液量为 20,mL时，虽然溶解氧量充足，但是由于养分不足，菌体生长缓慢，导致耐酸性高温α-淀粉酶活力下降．所以本实验选取30,mL/250,mL为最适装液量．

图6 装液量对产酶的影响Fig.6 Effects of medium volume on the yield of enzyme

2.3.4 摇床转速对产酶的影响

摇床转速同样影响发酵液中氧气的溶解量．由表 4结果显示，当摇床转速较低时，发酵液中氧气的溶解量不足，不利于菌体生长，导致耐酸性高温α-淀粉酶活力下降，因而耐酸性高温α-淀粉酶活力随着转速的升高而变高，当达到200,r/min时，耐酸性高温α-淀粉酶活力达到最高，为3,980,U/mL．随着摇床转速的继续升高，耐酸性高温α-淀粉酶活力却随之降低，所以本实验选取200,r/min为最适摇床转速．

表4 转速对产酶的影响Tab.4 Effects of rotation speed on the yield of enzyme

2.3.5 温度对产酶的影响

培养温度对菌株产酶的影响结果见表5．

表5 培养温度对产酶的影响Tab.5 Effects of cultivated temperature on enzyme production

由表 5结果显示，低温不利于菌株生长产酶，随着温度升高，反应速度加大，生长代谢加快，生产期提前，菌株的产酶量大幅度提高，当温度到达 37,℃时，菌体的生长最旺盛，菌株的产酶活力大幅度增加，耐酸性高温α-淀粉酶活力达到最高，为 3,980,U/mL．但是随着温度的继续升高使得菌体易于衰老，发酵周期缩短，导致产物的最终产量降低．所以本实验选取37,℃作为最适发酵温度．

3 结 论

枯草芽孢杆菌工程菌株 pWB-amyd/WB600，具有高拷贝的重组表达质粒，且具有良好地遗传稳定性，可高效表达耐酸性高温α-淀粉酶．本研究在此基础上，对该工程菌株进行发酵培养基及发酵条件的优化．分别研究碳源、氮源、金属离子以及磷酸盐对耐酸性高温α-淀粉酶活力的影响，通过正交实验进一步分析，确定最适发酵培养基为(g/L)：玉米粉 20，蛋白胨 30，CaCl20.5，Na2HPO48．同时，确定了摇瓶最佳发酵工艺：将重组菌的单菌落接种于种子培养基(50,mL/250,mL三角瓶)中，于 37,℃、200,r/min条件下培养18,h后，以2%接种量接种于优化后的发酵培养基(30,mL/250,mL 三角瓶)中，初始 pH 6.5，37,℃、200,r/min培养 36,h后，最终得到的耐酸性高温α-淀粉酶活力为3,980,U/mL，是优化前活力的2.1倍．

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