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猪小肠肠粘膜/浆膜/肠衣中的粘多糖组成分析

2012-05-07高照明曹现平张迎迎张玉冰

化学与生物工程 2012年4期
关键词:肠衣软骨素肝素钠

高照明,曹现平,张迎迎,张玉冰

(青岛科技大学化学与分子工程学院,山东 青岛 266042)

2008年初,美国及欧洲等12个国家发生了严重的肝素钠注射液不良反应事件[1],数百例病人出现过敏反应,表面皮肤水肿,心跳过快,血压过低,恶心呕吐[2],约百例病人死亡[3]。自美国FDA应用1HNMR和CE查出此批肝素钠(Heparin sodium,HP)原料中存在类肝素钠杂质——多硫酸软骨素(Oversulfated chondroitin sulfate,OSCS)[2],可能为引起病人不良过敏反应的异常杂质[4]之后,在数批肝素钠及低分子肝素钠中均发现了OSCS[5]。究竟OSCS是否为致命的罪魁祸首,各国专家从分子结构、药理、临床、来源等方面对其进行了论证[2~6]。Kishimoto等[7]证实OSCS是引发过敏反应的污染物,其在血浆中激活激肽释放酶产生缓激肽,诱发了过敏毒素的产生。Zhang等[3]证实杂质硫酸皮肤素(Dermatan sulfate,DS)、硫酸软骨素(Chondroitin sulfates,CS)无毒,而OSCS有毒,可能是导致百例病人死亡的原因。

关于OSCS的来源引起了各国科学家的纷争:Guerrini等[2]认为OSCS不是天然存在的,而是人工合成的;Pan等[8]指出肝素钠事件中,OSCS并不是未分级肝素钠中唯一的污染物,与人工合成OSCS相比,OSCS更可能来源于多硫酸化的糖胺聚糖废料;Keire等[9]认为OSCS是人工半合成的,是人为添加到肝素钠中的。

作者在此从肝素钠的来源——猪小肠着手,将猪小肠分离为肠粘膜、浆膜、肠衣三部分并分别酶解提取其中的粘多糖,进而对粘多糖成分进行分析,以期对OSCS的来源进行深入研究。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜猪小肠购于青岛李沧西流庄市场。

胰蛋白酶、D-254树脂,青岛九龙生物医药有限公司;重水(D2O),氘代度99.8%,CIL公司;三甲基硅丙磺酸钠(TSP),氘代度98%,Sigma公司;NaCl、HCl、乙醇,分析纯,青岛正业化学试剂厂。

Bruker AV500型核磁共振波谱仪,瑞士Bruker公司。

1.2 肠粘膜、浆膜、肠衣中粘多糖的提取

将新鲜猪小肠洗净,用竹刀轻刮出肠粘膜并收集;再将猪小肠最外层的浆膜剥离并收集;剩余部分即为肠衣。

将肠粘膜/浆膜/肠衣投入反应锅,按其质量的5%加入胰蛋白酶,用3 mol·L-1的NaOH溶液调pH值为8~9,同时搅拌升温至40 ℃左右,维持2.5 h;再升温至60 ℃,按肠粘膜/浆膜/肠衣质量的2%加入NaCl,升温至90 ℃,调pH值为6~7,加热至沸腾,保持10 min,趁热用200目尼龙筛过滤;待滤液冷却至60 ℃左右,用3 mol·L-1的 NaOH溶液调pH值为8~9,按滤液量的5%加入D-254树脂,搅拌吸附6 h,静置1 h(吸附过程保持pH值为8~9),过200目尼龙筛;在树脂中加入等体积自来水漂洗数次,用pH值为10的3 mol·L-1NaCl溶液搅拌洗脱树脂2 h(NaCl溶液用量与树脂量相等);过200目尼龙筛,收集滤液;重复洗脱2次,合并滤液;在滤液中加入等体积乙醇,搅拌10 min,静置12 h以上;收集下层沉淀物,用乙醇脱水3次;将沉淀物置60 ℃烘箱中烘干,得粘多糖。

1.3 分析检测

采用1HNMR对提取的粘多糖进行定性、定量分析。

1H的共振频率为500.03 MHz;脉冲序列(PULPROG)为zgcppr;采样次数(NS)为100次;谱宽(SWH)为9615.385 Hz;采样时间(AQ)为3.407940 s;温度(TE)为298 K;驰豫时间(D1)为10.00 s。

2 结果与讨论

2.1 HP、CS、DS、OSCS的1HNMR特征峰归属

CS、DS、OSCS作为HP的类似物质与HP在结构等方面十分相似,故测定HP中的CS、DS、OSCS有一定难度,本实验从每种物质的USP鉴别标准品的1HNMR研究入手,找出能代表每种物质的特征峰,使得分析HP中的类似物质变得简单可行。HP、CS、DS、OSCS的1HNMR图谱见图1。

图1 HP、CS、DS、OSCS的1HNMR图谱

由图1可以看出:每种单一物质的糖环区域质子化学位移均集中在3.0~6.0 ppm之间,且重叠、复杂,无从分析,但在化学位移2.0 ppm左右均有尖锐独立的单峰,容易分析;HP、CS、DS、OSCS二糖单元中N-乙酰氨基中甲基的信号分别出现在化学位移(ppm)2.04、2.03(CS-A)、2.02(CS-C)、2.08、2.15处,虽然化学位移相近但并不相同。故确定这4种类似物质的1HNMR的特征峰分别为2.04 ppm、2.03 ppm(CS-A)、2.02 ppm(CS-C)、2.08 ppm、2.15 ppm,运用各自特征峰分析HP中的杂质变得简单可行。

为了验证在同一批肝素钠样品中各特征峰是否能分开,将上述4种物质按比例(HP∶CS∶DS∶OSCS=60∶10∶25∶5)混合,其1HNMR图谱见图2。

图2 肝素钠混合品的1HNMR图谱

由图2可以看出,肝素钠混合品中含有OSCS、DS、CS等杂质,并能通过特征峰峰高方便地计算出各自含量[10,11]。

2.2 肠粘膜、浆膜、肠衣酶解产物的粘多糖成分的定性分析

6 kg的新鲜猪小肠经分离后得到3.6 kg肠粘膜、0.9 kg浆膜、1.5 kg肠衣,再经过酶解、盐解、去蛋白核酸、树脂吸附、洗脱、沉淀、烘干,得到褐黄色的2.58 g肠粘膜产品、0.66 g浆膜产品、1.08 g肠衣产品。用1HNMR分别对其进行定性分析,结果见图3。

图3 肠粘膜(a)、浆膜(b)、肠衣(c)的1HNMR图谱

由图3a可以看出,肠粘膜粘多糖的主要成分为HP(δ2.04),且含有DS(δ2.08)、CS-C(δ2.02)等杂质,但δ2.15左右无特征峰出现,说明不含OSCS杂质。峰高(Peak height,PKH)大小依次为:PKHHP>PKHDS>PKHCS-C,说明杂质的相对含量DS>CS-C。

由图3b可以看出,浆膜粘多糖的主要成分为HP(δ2.04)和DS(δ2.08),且含有CS-C(δ2.02)杂质,但δ2.15左右无特征峰出现,说明不含OSCS杂质。PKHDS≈PKHHP>PKHCS-C,说明DS与HP含量相当,含有少量杂质CS-C。

由图3c可以看出,肠衣的主要成分为DS(δ2.08),且含有HP(δ2.04),CS-A(δ2.03)、CS-C(δ2.02)等杂质,但δ2.15左右无特征峰出现,说明不含OSCS杂质。PKHDS>PKHHP>PKHCS-A>PKHCS-C,说明杂质的相对含量HP>CS-A>CS-C。

2.3 肠粘膜、浆膜、肠衣酶解产物的粘多糖成分的定量分析

根据1HNMR图谱(图3)中的各特征峰峰高对各成分进行定量分析,结果见表1。

表1 肠粘膜、浆膜、肠衣中粘多糖的定量分析

从表1可以看出:肠粘膜粘多糖中,HP占47.23%,DS占36.95%,CS-C占15.81%,不含CS-A和OSCS杂质,产物总质量为2.58 g,故HP、DS、CS-C的含量分别为1.22 g、0.95 g和0.41 g,其中含量最高的为HP,其它含量DS>CS-C;浆膜粘多糖中,HP占43.62%,DS占44.77%,CS-C占11.61%,不含CS-A和OSCS杂质,产物总质量为0.66 g,故HP、DS、CS-C的含量分别为0.29 g、0.30 g、0.08 g,其中DS和HP的含量相当,CS-C含量相对较少;肠衣粘多糖中,HP占31.46%,DS占38.52%,CS-C占13.61%,CS-A占16.42%,不含OSCS杂质,产物总质量为1.08 g,故HP、DS、CS-C、CS-A的含量分别为0.34 g、0.42 g、0.15 g和0.18 g,其中含量最高的为DS,其它含量HP>CS-A>CS-C。

将肠粘膜、浆膜、肠衣的粘多糖峰高百分比与含量列表进行比较,结果见表2。

表2 肠粘膜、浆膜、肠衣中粘多糖组成比较

由表2可以看出:

(1)HP在肠粘膜中占47.23%,在浆膜中占43.62%,在肠衣中占31.46%。故,HP在各部分的百分含量大小依次为:肠粘膜>浆膜>肠衣;HP在各部分的含量大小依次为:肠粘膜(1.22 g)>肠衣(0.34 g)>浆膜(0.29 g)。

(2)DS在肠粘膜中占36.95%,在浆膜中占44.77%,在肠衣中占38.52%。故,DS在各部分的百分含量大小依次为:浆膜>肠衣>肠粘膜,其中DS在浆膜中的百分含量最高,在肠粘膜和肠衣中的百分含量相近;DS在各部分的含量大小依次为:肠粘膜(0.95 g)>肠衣(0.42 g)>浆膜(0.30 g)。

(3)CS-C在肠粘膜中占15.81%,在浆膜中占11.61%,在肠衣中占13.61%。故,CS-C在各部分的百分含量大小依次为:肠粘膜>肠衣>浆膜,但相差不是很大;CS-C在各部分的含量大小依次为:肠粘膜(0.41 g)>肠衣(0.15 g)>浆膜(0.08 g)。

(4)CS-A在肠衣中占16.42%,质量为0.18 g,在肠粘膜、浆膜中均不含CS-A杂质。

综上,HP作为要分离的有效产物,在肠粘膜(1.22 g)、浆膜(0.29 g)、肠衣(0.34 g)中的含量比例为66.0∶15.6∶18.4,表明有效成分HP主要来源于肠粘膜;而有害物质OSCS在这三部分中均未发现。

3 结论

采用酶解法提取猪小肠肠粘膜、浆膜、肠衣中的粘多糖,并通过1HNMR对提取的粘多糖成分进行定性、定量分析。结果表明,肠粘膜的粘多糖主要成分为肝素钠,并含有硫酸皮肤素和硫酸软骨素C;浆膜中肝素钠和硫酸皮肤素的含量相当,并含有少量硫酸软骨素C;肠衣的粘多糖主要成分为硫酸皮肤素,并含有肝素钠、硫酸软骨素A及硫酸软骨素C;肠粘膜、浆膜、肠衣均不含多硫酸软骨素。

参考文献:

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