脂肪注射移植后皮肤质地改善的研究

祝顺武,宋广滨,徐学武,刘国锋

[摘要]目的：通过皮下脂肪注射移植，探索移植脂肪对皮肤质地的改善作用。方法：取30只裸鼠，随机分成三组，所有鼠左侧皮下移植人脂肪细胞，在另一侧10只注射硅凝胶，10仅行皮下穿刺，剩下10只无任何处置，8周取皮肤组织做HE、Masson'染色观察皮肤真皮层厚度及真皮层内胶原蛋白的含量。结果：取材时，所有裸鼠上都能看到所移植的脂肪，但体积较术前有较明显缩小。肉眼看，脂肪呈正常外观，有较多新生血管生成。组织学检测，移植脂肪外周有大量细胞外基质形成，实验侧真皮层较对照侧明显增厚，真皮内胶原含量增多。结论：移植的脂肪组织不仅仅是一种填充物，在改善轮廓的同时，还有真皮增厚、胶原含量增加等皮肤改善的效应。

[关键词]脂肪注射移植；皮肤质地改善

[中图分类号]R622[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）01-0078-04

Study on the Improvement of skin quality after fat tissue grafting: a animal studying

ZHU Shun-wu,SONG Guang-bing,XU Xue-wu,LIU Guo-feng

(Department of Plastic Surgery,2nd Hospital of Harbin Medical University Harbin,150086, Heilongjiang,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the histologic modifications of the skin after fat tissue grafting.MethodsThirty nude mice,divided into three groups randomly,were used in the experiment.All 30 mice received human fat tissue on left side.On the opposite side,10 mice received silicone gel,10 mice received only subcutaneous tunneling,and the remaining 10 mice received nothing (negative control group). Eight weeks later, biopsies of the skin and ubcutaneous tissue were performed and specimens were analyzed by hematoxylin-phloxin-saffron and Masson' staining. Dermis thickness was measured.ResultsFat tissue was found in all animals. Macroscopically,fat tissue presented normal aspects,with abundant peripheral neovascularization.Histologic examination showed abundant extracellular matrix around the injected human fat tissue. Dermal thickness after fat grafting was significantly greater and collagen also increased significantly.ConclusionsThis study shows that fat tissue grafting stimulates a neosynthesis of collagen fibers at the recipient site and makes the dermis thicker. The effect it presented at the grafted area was not just volume-increasing but skin quality improvement.

Key words: fat tissue grafting; skin quality improvement

目前，自体脂肪组织被公认为最好的软组织填充材料之一，填充效果好，并发症出现率低。在临床应用中，有学者发现，自体脂肪组织注射移植不仅仅是一个填充物，在改善术区轮廓的同时，还有真皮增厚，真皮内胶原含量增加等皮肤质地改善的效应。然而，在人体做脂肪移植前后皮肤活检是难以接受的，因此我们以祼鼠为模型设计动物实验，在组织学上观察和比较脂肪移植前后皮肤质地的变化。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1 实验动物：选用 BALB/c裸鼠30只，雌性，7周龄(北京维通利华生物有限公司)。SPF环境下饲养，自由取食水。

1.1.2 志愿者选择：经书面许可，脂肪细胞在全麻下取自两个志愿者。志愿者体重指数应为25左右，身体健康，年龄≥18周岁，≤40周岁。

1.2.3 试剂：HE染色液、Masson 染色液、硅凝胶（由医大二院组织工程实验室赠送）。

1.2 方法

1.2.1 动物及注射物的准备

1.2.1.1 实验动物分及标记：将30只祼鼠随机分成A, B, C三个组。标记时我们采用耳缺法标记。

1.2.1.2 脂肪获取及处理:获取方法为Comleman法：用直径3mm末端光滑的管，接10ml Luer Lock注射器吸出脂肪细胞。获取后立即送往实验室处理。3000rpm离心3min，弃上清液和底层血和碎屑，取中层纯脂肪组织，分装至1ml注射器中备用，每个志愿者所获取的脂肪细胞用于15只祼鼠。

1.2.1.3 硅凝胶处理：同上，将硅凝胶转移至1ml注射器中备用。

所有移植物准备完成后，将所有装有移植物的注射器无菌包装，置于有冰块的保温盒中，送往动物实验室的操作室注射移植。

1.2.2 注射移植：所有祼鼠背部一侧注射脂肪细胞，两个志愿者的脂肪细胞各注射15只。A组祼鼠背部另一侧注硅凝胶，B组另一侧仅行注射针皮肤穿刺但无注射，C组无任何操作即空白组。

1.2.2.1 麻醉：2.5%戊巴比妥钠 45mg/kg 体重腹腔注射麻醉，麻醉满意后，先用亚甲蓝在祼鼠背部拟注射的部位作标记，将祼鼠四肢展开，俯卧位平放在操作台无菌单上。用碘伏常规消毒其背部及部分腹部，铺四层无菌孔巾，仅暴露背部需注射部位。

1.2.2.2 注射移植：注射时用脂肪移植的专用注射针头注射。在注射区域边缘用剪刀剪一个约2mm小口，将脂肪移植用针头接装有移植物的1ml注射器，注射头从剪开的小口进入注射区，呈扇形注射，每通道注射约0.1ml，完全进针后，边注射边退针。注射完后，剪开的小口用5-0无创伤线缝合一针。缝合后，轻轻按摩注射区，尽量使注射区域平整。

每注射完一次，将注射针头用生理盐水冲洗两次，然后接下一个注射器注射移植。

1.3 移植后观察：移植完成后，每日在同一时间点测体重。

1.4 取材：在注射后第4和第8周，将各组祼鼠各处死一半，处死时用颈椎脱臼法。用亚甲蓝在所需取材的部位作标记。沿标记线，切取大小约1cm×1cm包含注射物的皮肤组织，皮肤面向下，平置于包埋盒上，再将包埋盒置于4%甲醇中固定。后将组织转送到实验室。

1.5 观察指标：HE染色以测真皮厚度：取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片，HE染色。

Masson'染色以测真皮内胶原含量：组织固定包埋切片后，Regaud苏木精染液、Masson 丽春红酸性复红液、苯胺蓝分别染色。

1.6 统计分析：所有数据应用spss 16.0 统计软件统计分析，应用t检验。

2结果

所有祼鼠，注射移植后成活良好，无一只死亡。肉眼看，注射移植脂肪成活，表面有大量毛细胞血管生成，而且，脂肪移植侧血管数较对侧增多，见图1。

2.1 体重变化：穿刺组与空白组，其左侧注射脂肪，右侧无注射物，注射后1周左右因注射脂肪存在吸收，体重有一定的下降，两周后裸鼠体重增长大于脂肪吸收，其体重表现为逐渐增加。注射凝胶组在注射3天后未见体重下降，反而增加，在注射后1周表现小副下降，后逐渐增加。具体数据见表1。

2.2 HE染色：细胞核蓝色，胞质，肌纤维，胶原纤维和红细胞呈深浅不一红色。HE染色后，组织结构层次清晰，切片示脂肪移植侧不仅真皮层增厚，还可见血管数明显增多。用IPP 6.0图像分析软件下测真皮的厚度（表皮至真皮下结缔组织之间的距离），见图1。经测量，实验组平均真皮厚度在注射后4周为（326.00±26.27）μm对照组分别为（188.03±18.53）μm、（255.75±23.2）μm、（240.26±22.57）μm。8周时真皮厚度无明显变化。实验组较对照组明显增厚，统计得P<0.05，有统计学意义。其中凝胶组真皮最薄。具体见表2。

2.3 Masson'染色：胶原纤维呈蓝色，胞浆、肌肉、纤维素呈红色，胞核黑。脂肪移植侧真皮内胶原含量较对照组明显增多，见图3。

3讨论

3.1 Coleman早于1990年就提出脂肪移植后皮肤质地有改善。在多年脂肪移植临床工作中，他发现脂肪移植后，受区不仅丰满了，在脂肪移植第一年里，皱纹减轻，毛孔缩小，及色素沉着减少[1-2]。与Coleman一样，在临床脂肪移植应用中Ali Mojallal 等人发现，脂肪移植后，皮肤纹理、毛孔大小、皮肤柔软度、皮肤颜色及瘢痕质地都得到了改善，并通过动物实验从组织学上证实[3]。而本实验也从这方面通过动物实验证实脂肪移植对皮肤质地的改善。

3.2 在本实验中，在脂肪移植后1周左右，所有鼠体重都有所下降，这可能是有两方面的原因，一是注射的脂肪纯度不能是100%的，虽然在移植前经过离心，但还是有一定的组织液及冲洗用的生理盐水，这部分液体在注射后短期内定会被机体吸收；二是脂肪的吸收，这是目前脂肪移植的一个难题。但在注射大约1周后，裸鼠的体重增长量大于脂肪吸收的量，同时，脂肪的吸收量渐趋向稳定，此时，主要表现为裸鼠体重逐渐增加。其中注射凝胶组，注射移植一周内体重下降不明显，这可能是凝胶注射后，有亲水性，与体内的组织液结合，反而增加了注射物的量。但3天后还是能表现出左侧脂肪的吸收，体重有小副下降。

在注射移植后4周与8周取材观察，穿刺组与空白组无明显区别，但注射凝胶组较空白组有明显薄，这可能是，凝胶为非生物性物质，不可吸收，注射移植后在皮下实质性占位，对皮肤有一个持续扩张作用，因此皮肤变薄。而真皮内胶原含量，各对照组间无明显区别。

3.3 但与三个对照组比较，实验组的真皮厚度及真皮内胶原的含量都有明显的区别，其改善的机制，人们认为脂肪组织不仅仅是一个简单的储存能量的地方，而且是一个重要的内分泌器官，除调节代谢外，在免疫、血管生成等方面都具有重要作用[4-8]。在脂肪组织中，除脂肪细胞外，包含其它细胞，如脂肪源性间充质干细胞（ASCs）、前脂肪细胞、巨噬细胞、内皮细胞等[6-7,9-10]，这些细胞中尤其ASCs有分泌VEGF，HGF， TGF-b，PDGF，FGF，SDF-1等生长因子或细胞因子作用[5-7，11-14]。而这些因子，可能在改善皮肤质地中起重大作用：

3.3.1 增加胶原复合物：上述的多种生长因子，一方面，促进纤维母细胞增殖，从而增加了胶原复合物的分泌；另一方面，促进纤维母细胞分泌胶原复合物。这一双重作用，真皮内胶原复合物增多，真皮增厚[15-16]。

3.3.2 促血管增生：促进血管内皮细胞增殖，从而使血管增生，给皮肤带来更多的营养，从而改善皮肤质地。在所有脂肪移植，或ASCs移植中，无论是肉眼观察或是微观组织检查，都无一例外地观察到了移植物周围及内部新生血管增多[3，12，15-19]。

3.4 其它如ASCs的多方向分化潜能作用[20-22]，一方面向脂肪细胞转化，增加脂肪移植效果；另一方面向血管内皮细胞转化，起血管生成重用[23-26]。脂肪组织中其它如细胞前脂肪细胞、脂肪细胞、细胞外基质、胶原蛋白生物活性片段（Matricryptins）的作用等。例如前脂肪细胞、脂肪细胞也可分泌一定的细胞因子；前脂肪细胞向脂肪细胞的转化；细胞外基质、Matricryptins在皮肤质地改善中的调节作用等[6-12]。尚有待进一步研究。目前，在脂肪移植后皮肤质地改善的机制研究中，主要是针对ASCs研究，并取得了一些进展。这可能不是某单一因素的结果，脂肪作为一个外植入物的整体，引起了机体的神经体液反应，从而引起的一系列调节的整体效果。

3.5 这些假设，都与本实验有相符，实验组脂肪注射移植侧有皮肤质地改善作用，但对侧，其结果都是阴性。注射凝胶，与注射脂肪一样，有一个填充作用，但与注射脂肪不同，对皮肤质地并无改善作用。穿刺组，与脂肪注射移植一样，对皮肤有相同的创伤刺激，其阴性结果也正好说明，脂肪移植时对皮肤的穿刺刺激并不是皮肤质地改善的主因。而空白组，随时间的推移，其皮肤厚度并没有增厚，说明脂肪移植侧是脂肪移植起到了作用，并不是裸鼠本身的生理性增厚。

3.6 皮肤年轻化治疗人类的永恒追求，从手术到各种注射美容，一直在迅速发展。本方向的研究，是临床发现在实验中的证实，虽然对于不存在凹陷性缺陷的患者用以年轻化治疗的直接临床应用上有一定的局限，但如果能进一步研究，探索出皮肤质地改善的机制，从中得出新的皮肤年轻化治疗的方法，那必将有极大的意义。

4结论

实验显示，自体脂肪组织在注射移植后不仅仅是一个填充物，在改善术区轮廓的同时，还有使皮内胶原含量增加、真皮增厚等皮肤质地改善的效应。如果能进一步研究，探索出皮肤质地改善的机制，从中得出新的皮肤年轻化治疗的方法，那必将有极大的意义。

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[收稿日期]2011-08-25 [修回日期]2011-10-23

编辑/张惠娟