组织工程软骨种子细胞研究进展

王师平　郭树忠

组织工程是应用生命科学和工程学原理，研究开发能够修复、维持或改善组织损伤能力的生物替代物的一门学科[1]。利用组织工程方法再造软骨，为临床上软骨缺损的修复带来了新的途径，种子细胞作为软骨组织工程学研究的首要方面，它的来源途径也就尤为重要。目前的组织工程软骨种子细胞的来源主要为自体软骨细胞、同种异体软骨细胞、成纤维细胞、干细胞、转基因细胞等，成熟软骨细胞是最常被关注的种子细胞，人们已经深入研究了其产生、维持和改造软骨细胞外基质的作用；成纤维细胞来源广泛，并能诱导其直接向软骨转化[2]；干细胞的研究则成为近期的热点，它不但有多向分化潜能并可来源于多种组织，这类细胞可在维持其分化潜能的前提下通过多种途径扩增，此外干细胞还能通过基因学上的改变来诱导或增强软骨化过程。目前的研究目标就是找到一种能被简单分离出来，具有扩增能力并能在培养过程中表达和合成软骨特异成分（如Ⅱ型胶原和糖胺多糖）的理想种子细胞[3]。

1各种成熟软骨细胞

自体软骨细胞是当前组织工程研究中最常用的种子细胞来源。目前，许多研究倾向于使用关节软骨细胞作为软骨修复的可行性细胞来源，但是获取关节软骨是有创的并且潜在供区并发症和功能损伤。此外，细胞收获率低、分裂速度慢和生物活性低等缺陷都进一步限制了关节软骨的临床应用。由于以上限制，研究者已着手寻找其他自体软骨细胞来源，这包括耳软骨、鼻软骨和肋软骨等。由于这些自体软骨在部位、功能和组成上的不同而造成它们在细胞外基质的生成、生化、物理性质和生物力学方面的差异，因此，应根据实际情况具体选择使用[3]。

弹性软骨包括形成耳的耳廓软骨和会厌软骨，Van Osch等[4]提出人类耳廓软骨有应用于软骨修复的潜力。与关节软骨相比，耳廓软骨的细胞获取量可提高20%并且其细胞增殖速度较前者快4倍；体内培养时，通过特殊染色观察到它可形成富含蛋白多糖的基质；此外，在体内培养时耳廓软骨与关节软骨相比，前者在生物化学和组织学上与未成熟软骨有更高的相似性[5-7]。鼻软骨是一种透明软骨，它在颅颌面外科与整形外科得到了广泛的应用。成体鼻软骨能生成较多的Ⅰ/Ⅱ型胶原并能蓄积GAG[8]。此外，鼻软骨在单层培养时细胞增殖速度较关节软骨快4倍[8]，并能低密度种植培养且不会发生去分化作用[9]。同时，在不同的载体和支架上，鼻软骨细胞已被成功地培养成多细胞大颗粒聚集体[10-11]。其他研究还表明在去血清培养时，鼻软骨细胞能对TGF-β1、FGF-2、BMP-2和IGF-1[12]等生长因子应答，同时其增殖速度和基质沉积量也有所提高。

在一项软骨细胞来源的对照研究中，研究者把牛鼻软骨、肋软骨和耳软骨细胞置于多聚合物支架上生长4周[13]，不同软骨细胞的增殖率和基因表达情况各不相同，其中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达量最高的是肋软骨细胞，然后是鼻软骨、关节软骨和耳软骨细胞；同时不同细胞增殖后构成的形状也有差别，关节软骨细胞增殖后直径最大而肋软骨细胞形成结构则最厚。另一项研究关注生长因子对以上各软骨细胞的作用，其具体作用表现为可加快细胞增殖速度、提高GAG/DNA含量和增量调节Ⅱ型胶原的表达；然而再分化现象仅发生于耳廓软骨和鼻软骨细胞增殖过程中[14]。此外，Johnson等[15]指出在活体内，关节、耳和肋软骨细胞在纤维蛋白胶软骨合成物上培养时，可形成新的软骨基质。

2成纤维细胞

成纤维细胞容易培养，且扩增性极好，对组织工程学来说，成纤维细胞不但来源充足，并且从皮肤取材其创伤较小。虽然将成纤维细胞直接植入软骨缺损区会导致纤维组织生成[16]，可是在适当的培养条件下，成纤维细胞可重新向软骨组织分化。经IGF-1预先处理的人皮肤成纤维细胞培养于蛋白多糖样聚合物上，其GAGs和Ⅱ型胶原染色呈阳性[17]；此外，当培养于去矿物质骨[18]或生长于乳酸[4]环境中，皮肤成纤维细胞可表达软骨特异性的基质蛋白，如蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。同时，成纤维细胞可表达TGF-β，将其注射入软骨缺损处，在6周后可观察到有新生透明软骨生成[19]。最近，Deng等[20]分离出一种皮肤来源的细胞亚群，这种细胞命名为“真皮来源蛋白多糖敏感细胞（DIAS）”。此外，DIAS细胞的立体自我分化增殖可形成丰富的软骨特异性细胞外基质。

3干细胞

近来，干细胞作为自身软骨种子细胞来源的又一选择，引起了组织工程界的广泛关注。1998年，研究者发现骨髓干细胞在有TGF-β1存在下以细胞团块的方式培养时可有软骨形成[21]。之后，脂肪组织被发现也可作为一种干细胞来源，并且它可通过简单的局麻手术即可分离获得[22]，此外，研究用于软骨修复的干细胞还可来源于肌肉[23]、滑膜[24]和骨膜[25]等。

3.1 骨髓间充质干细胞（BMSCs）：骨髓中只含有少量间充质干细胞，仅占骨髓细胞的0.01/万～1.00/万，并随年龄的增加而减少。体外单层培养的间充质干细胞外形类似成纤维细胞，呈长梭形且体积较大。原代细胞接种贴壁后可形成2～4个细胞组成的细胞团，经过2～4天的潜伏期后开始迅速地克隆性扩增，类似漩涡状盘旋排布，经传代的细胞形态更趋一致，对数增长期细胞倍增时间为33～38h。具有强大的增殖扩增能力是BMSCs一个重要的生物学特征，其可稳定传至20～25代而不改变细胞性状，Conget等[26]检测人BMSCs中约有20%的细胞处于静止期（G0期），此比例足以维持增殖分化所需的细胞供给。Colter等[27]报道极低密度培养能保持BMSCs的增殖力，20ml的骨髓样本经3代6周的培养可扩增2×109倍，达1013个细胞，相当于成年人体细胞总数。具有多向分化的潜能是BMSCs最重要的生物学特征，近年来已被大量研究所证实。在适宜的体内或体外环境下BMSCs不仅可以分化为间充质组织，还保持有内外胚层的组织发育分化潜能，可以分化为神经系统、肝脏、肺脏、上皮组织等。Friedenstein首先证实了BMSCs具有分化为骨、软骨、纤维组织的能力。有学者在单层培养条件下大量扩增BMSCs，也有学者在单层培养下对BMSCs 进行定向分化诱导。Worster等[28]对来源于马的BMSCs定向诱导成软骨细胞，检测到软骨细胞特征标识物及观察到具有软骨细胞形态的细胞，但未观测到软骨样组织形成。Yoo等[29]对体外单层或聚集立体培养下的成人BMSCs进行比较，发现在其他条件相同时，立体培养的BMSCs发生了定向软骨分化，而单层培养则无软骨形成。Liechty等[30]将人BMSCs移植入早期妊娠的胎羊，异种的细胞入住多种组织存活达13 个月，并按接种部位特异性地分化为软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、心肌细胞，说明BMSCs不仅保持了多分化潜能且具有独特的免疫学特性。

3.2 脂肪干细胞：脂肪组织中可分离出外形类似成纤维细胞样的脂肪干细胞，其在体外培养时有稳定的增殖速度且不易老化。经免疫荧光法和流式细胞计数分析确定，这些细胞起源于间充质细胞，它们在TGF-β、维生素C和地塞米松存在并通过立体培养可向软骨细胞分化 [31]。高浓度微块培养[32]或将其接种在藻酸盐[33-34]、琼脂糖[33]和胶原支架[33，35]时分化可以实现。体外培养时，成软骨诱导的脂肪衍生干细胞（ADSCs）可产生软骨特异性细胞外基质，并且存在均一的张力和剪切模量以及硫酸化的GAGs沉积[33]。Masuoka等证实，将ADSCs接种于Ⅰ型胶原构成的蜂窝状支架，在兔身上构建的透明软骨可修复全层软骨缺损[35]。此外，一种新的弹力胶原样多肽已被证明能在无培养基的情况下促进ADSCs向软骨分化[36]，培养两周后其聚集的硫酸化GAGs和Ⅱ型胶原量与在标准培养基培养的情况类似。

3.3 胚胎干细胞：胚胎干细胞来源于植入子宫前的胚胎，可来自早期胚胎的内细胞团或尿生殖嵴， 是一种可在体外长期培养并保持高度分化潜能的细胞。目前，人胚胎干细胞的细胞系己成功建立。胚胎干细胞是全能干细胞， 可分化为三个胚层所有类型的细胞， 种植于体内可形成包含三胚层细胞的畸胎瘤。改变体外培养条件， 可使胚胎干细胞向不同的细胞系分化。己有文献报道胚胎干细胞在BMP-2和BMP-4的作用下分化为软骨细胞[37]。但使用胚胎干细胞作为组织工程的种子细胞主要是存在伦理学问题， 此外， 如何控制干细胞向特定类型细胞分化，分化后的种子细胞在宿主体内是否具有致瘤性等问题仍值得深入研究。在软骨组织工程的潜在种子细胞中， 干细胞与已分化的成熟软骨细胞相比， 除具有更强的增殖能力外， 还具有再生潜能， 可维持整个生命过程中细胞的更新和正常功能， 因而干细胞作为种子细胞可能更具优势。

4转基因细胞

细胞的生长、定向分化和活性维持均需生长因子的调控。利用转基因技术将生长因子基因转入种子细胞， 转基因细胞可在缺损局部持续表达高生物活性的内源性生长因子， 调控其自身增殖分化， 延缓体外培养种子细胞的老化及去分化， 同时促进软骨细胞增殖、分化， 提高修复质量。Mason等[38]首先报道用基因治疗和组织工程法结合修复关节软骨。以逆转录病毒为载体把BMP27脱氧核糖核酸导入兔骨髓干细胞，种植至PGA支架培养后，移植至兔关节软骨损伤模型，8～12 周软骨基本修复。Davidson等[39]用FGF218通过其受体3促进了软骨细胞生长。基因转染可以用来调控软骨种子细胞增殖和维持其表型， 软骨细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞均可作基因治疗的受体细胞。通过体外软骨细胞转染基因， 既可对软骨基质的结构蛋白的突变起到补偿，还可以释放细胞因子增加基质的合成， 促进软骨的修复， 又可对抗局部炎症的发生。将具有免疫抑制作用的基因转入种子细胞可克服同种异体甚至异种细胞的免疫原性， 大大地拓展了软骨组织工程种子细胞的范围。

5展望

目前， 虽然对何种来源的细胞作为软骨组织工程的首选种子细胞仍有争议， 软骨组织工程种子细胞的许多问题尚待解决，如：种子细胞的改造、种子细胞培养扩增技术的完善，如何延长细胞的寿命、降低细胞抗原性及增强宿主免疫耐受等。但目前一般认为， 随着体外细胞培养技术的成熟， 大家公认的体外培养的自体细胞已经运用于临床， 且发挥了一定的作用。人胚胎干细胞和转基因细胞具有巨大的应用前景， 已开始逐渐成为软骨组织工程学研究的热点。

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[收稿日期]2012-05-28[修回日期]2012-07-13

编辑/李阳利