多重荧光PCR鉴别诊断猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒

陈静静 罗宝正 沙才华(等)

摘要：为了建立一种快速、灵敏、特异的能够同时检测猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的多重荧光ＰＣＲ方法，根据ＧｅｎＢａｎｋ中公布的猪瘟病毒基因序列，设计一套特异性的引物和探针，对猪瘟病料提取ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增后将产物回收，克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ构建ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ阳性质粒；非洲猪瘟的目的片段序列采用化学合成，构建ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ阳性质粒。以两种阳性质粒为模板对建立的多重荧光ＰＣＲ方法做特异性、灵敏度和重复性试验，结果表明该方法可以将猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒同口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪水泡病病毒、猪圆环病毒２型区分开，灵敏度可以达到１０拷贝的数量级，而且方法稳定。对２份已知猪瘟阳性血清样品和１２０份猪内脏、猪鼻腔拭子及血清样品检测后，发现对已知阳性样品的检测结果符合预期目标，未知样品检出猪瘟病毒３份阳性，未检出非洲猪瘟病毒阳性。

关键词：猪瘟病毒；非洲猪瘟病毒；多重荧光ＰＣＲ；检测

中图分类号：Ｓ８５５．３ 文献标识码：B 文章编号：１００７－２７３Ｘ（２０12）02-0004-03

猪瘟（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ，ＣＳＦ）又称猪霍乱（Ｈｏｇ cｈｏｌｅｒａ，ＨＣ），是由猪瘟病毒（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ vｉｒｕｓ，ＣＳＦＶ）引起的一种高度接触性传染病，世界动物卫生组织（ＯＩＥ）将其列为必须通报的动物传染病。１９世纪３０年代，该病在美国俄亥俄州首次报道，后来在亚洲、美洲、欧洲和非洲均有不同程度的流行。目前，虽然世界上有些国家宣布消灭了猪瘟，但是在亚洲、欧洲、非洲及南美洲的墨西哥、古巴等国家，猪瘟仍然存在［１，２］。由于该病暴发时会对养猪业造成严重的经济损失，而且在国际贸易中宣布无猪瘟国家往往会出台相关贸易政策限制猪瘟疫区国家猪肉和种猪的进口，所以对于很多猪瘟疫区的国家而言，早期检测猪瘟病毒对于猪瘟的防控和根除显得尤为重要。

非洲猪瘟（Ａｆｒｉｃａｎ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ，ＡＳＦ）是由非洲猪瘟病毒（Ａｆｒｉｃａｎ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ vｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）引起的一种猪的烈性、高度接触性传染病，在ＯＩＥ中也是被列为Ａ类动物传染病。虽然非洲猪瘟属于非洲本土病，但是从１９２１年肯尼亚第一次报道后到目前已经有４９个国家报道过非洲猪瘟疫情［３］，我国迄今虽然没有非洲猪瘟的发病报道，但由于与非洲猪瘟疫区国家有相关贸易活动所以存在该病潜入的风险。我国农业部在２００８年发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》中将猪瘟和非洲猪瘟都列入了一类动物疫病。

猪瘟和非洲猪瘟是猪的两种重要病毒病，虽然病原学分类不同，但是感染后临床症状及病理变化差别很小，单纯靠临床诊断和剖检变化不能区分两种病，只能依据实验室诊断才能定性。目前针对于猪瘟和非洲猪瘟的实验室诊断主要依据病原学、血清学及核酸检测技术。病原学和血清学方法存在一定的局限性，近年来在ＰＣＲ基础上发展起来的荧光ＰＣＲ技术以其直观、快速、灵敏、特异及污染性小等优点已广泛应用于动物疫病检测方面。本研究拟建立可同时检测猪瘟和非洲猪瘟的多重荧光ＰＣＲ方法，以期能在猪瘟和非洲猪瘟的疫情监测及综合防控中发挥独特作用。

１材料与方法

１．１材料

毒株：病毒均为疫苗毒。猪瘟疫苗，广东永顺生物制药有限公司；口蹄疫疫苗，中牧集团股份有限公司；猪传染性胃肠炎疫苗，哈尔滨兽医研究所；猪呼吸与繁殖障碍综合征疫苗，南京科农生物技术研究所；猪水泡病病毒ＲＮＡ和猪圆环病毒２型重组质粒为本实验室保存。

试剂和仪器：ＤＮＡ／ＲＮＡ磁珠提取试剂盒，购自深圳易瑞生物技术有限公司；Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒，ＤＮＡ胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒，ＤＬ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋ，ｐＭＤ１８－Ｔ购自宝生物工程（大连）有限公司；ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ，美国Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。

１．２方法

１．２．１病毒ＲＮＡ提取采用ＤＮＡ／ＲＮＡ磁珠提取试剂盒，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，分别提取猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的ＲＮＡ，将提取的ＲＮＡ于－２０℃保存，备用。

１．２．２引物和探针的设计合成在ＧｅｎＢａｎｋ上下载多条猪瘟病毒的全基因组序列，利用ＤＮＡＳｔａｒ进行序列比对后在保守区域５ＵＴＲ内设计一对引物和探针。非洲猪瘟的引物和探针采用ＯＩＥ公布的参考序列，引物探针由上海超世生物科技公司合成。序列见表１。

１．２．３猪瘟ＲＴ－ＰＣＲ使用引物对ＣＳＦＶ８１－Ｆ和ＣＳＦＶ８１－Ｒ以１．２．１中所提猪瘟病毒ＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，获取克隆用目的片段。使用ＴａＫａＲａ一步法试剂盒，体系如下：２×Ｂｕｆｆｅｒ １２．５ μＬ、ＣＳＦＶ８１－Ｆ（１０ μｍｏｌ／Ｌ）１．０ μＬ、ＣＳＦＶ８１－Ｒ（１０ μｍｏｌ／Ｌ）１．０ μＬ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ Ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ １．０ μＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ ７．０ μＬ、ＲＮＡ ２．５ μＬ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ＜１．０ μｇ），共２５ μＬ。反应程序：５０℃ ３０ ｍｉｎ，９５ ℃ ２ ｍｉｎ，９５ ℃ ３０ ｓ，５５ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ４０ ｓ，７２ ℃ ７ ｍｉｎ，３５个循环，反应结束后用２．０％琼脂糖凝胶电泳检测。

１．２．４阳性质粒的制备将１．２．３中获得的猪瘟ＲＴ－ＰＣＲ产物目的片段胶回收，纯化后克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体，转化至大肠杆菌感受态ＪＭ１０９，对培养后的克隆菌提取质粒。将重组质粒送至广州英骏公司测序，鉴定后即成功构建可用作猪瘟阳性对照的重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ。由于非洲猪瘟没有病料，将目的片段序列由宝生物工程（大连）有限公司合成，然后克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ构建ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ重组质粒。

１．２．５引物、探针浓度的优化使用ＴａＫａＲａ一步法试剂盒，体系为３５ μＬ，分别调整猪瘟１０ ｐｍｏｌ／μＬ的引物探针各１．０、１．２、１．５、１．８、２．０ μＬ与非洲猪瘟１０ ｐｍｏｌ／μＬ的引物探针各２．０、１．８、１．５、１．２、１．０ μＬ相混合，通过扩增曲线的Ｃｔ值和荧光高度直观看出最佳引物和探针浓度组合。

１．２．６特异性试验按照１．２．５中优化的猪瘟和非洲猪瘟的最佳引物和探针浓度组合配制多个荧光ＰＣＲ反应体系，分别加入猪瘟和非洲猪瘟、口蹄疫、猪传染性胃肠炎、猪繁殖与呼吸综合征、猪水泡病及猪圆环病毒２型的模板进行扩增。

１．２．７灵敏度试验将１．２．４中制备的重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ和ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ（浓度为1.2×1010ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）梯度稀释为１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ，分别以每个梯度质粒为模板，在荧光ＰＣＲ仪上反应。

１．２．８稳定性试验在多重ＰＣＲ反应体系中加入猪瘟１０５拷贝数的梯度和非洲猪瘟１０７拷贝数的梯度模板，做２０次重复。间隔３０ｄ再以此反应体系和梯度模板做２０次重复。对两次重复试验的Ｃｔ值用ＳＰＳＳ １３．０分析稳定性。

１．２．９临床样品检测将本研究中所建立的多重荧光ＰＣＲ方法对２份本实验室保存的已知猪瘟阳性血清和１２０份猪内脏、猪鼻腔拭子及血清样品进行检测。

２结果

２．１猪瘟ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果

由图１可看出，ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果与预期片段大小基本一致。

２．２重组质粒的PCR扩增结果

重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ和ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ的插入片段测序结果在ＮＣＢＩ经ＢＬＡＳＴ比对后与ＧｅｎＢａｎｋ中序列同源性较高。由图２可以看出，经ＰＣＲ扩增的片段大小在预期目标内。

２．３引物、探针浓度的优化结果

通过在荧光ＰＣＲ仪上扩增曲线的Ｃｔ值和荧光高度看，使用１０ ｐｍｏｌ／μＬ的引物、探针各１．５ μＬ的时，猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒都有良好的扩增曲线。

２．4特异性试验结果

由图３可以看出，本研究中的多重荧光ＰＣＲ反应体系只针对猪瘟和非洲猪瘟有特异性扩增，其他对照病毒无扩增曲线。

２．5灵敏度试验结果

由图４可以看出，本研究所建立的多重荧光ＰＣＲ方法可以检测到最低１０1ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的模板浓度。

２．６稳定性试验结果

猪瘟的批次内变异系数分别为２．５４％、１．７０％，批次间为２．１３％，两次结果无显著差异（Ｐ＞０．０５）；非洲猪瘟的批次内变异系数分别为１．３４％、１．３０％，批次间为１．５６％，两次结果无显著差异（Ｐ＞０．０５），说明该实验方法的稳定性良好。

２．７临床样品检测结果

２份猪瘟阳性血清检测结果全部为阳性（Ｃｔ＜３０），１２０份鼻腔拭子、猪内脏和血清中出现３份猪瘟阳性，阳性率为２．５％，未发现有非洲猪瘟阳性。

３讨论

我国是猪瘟多发国家，目前虽然没有非洲猪瘟的报道，但是建立相关实验方法对该病的监测却是不可或缺的。对于猪瘟和非洲猪瘟的诊断方法主要包括ＦＡＴ、ＥＬＩＳＡ，动物接种试验及核酸检测技术［４，５］。ＦＡＴ和ＥＬＩＳＡ方法对病料要求要尽可能新鲜，否则会降低病毒鉴定的可能性，而且当猪感染引起急性症状时短时间内机体往往难以产生足够的抗体，这样就可能会误判。动物接种试验时间较长，花费较大而且会引起动物福利问题，所以ＯＩＥ不推荐使用该法。ＴａｑＭａｎ探针荧光定量ＰＣＲ是通过检测反应体系中荧光强度的动态变化来定性、定量分析的一种实时荧光检测分析方法［６］，具有灵敏度高、特异性强及整个反应只需一次加样且污染性小的优点。

本研究中猪瘟和非洲猪瘟引物和探针的设计选择在各自基因高度保守区域内，最大程度上降低不同毒株之间的特异性，避免病原的漏检。由于建立的是多重荧光ＰＣＲ，所以在设计引物探针时还要避免两种病原引物探针间不能产生二聚体和发卡结构。同时，对猪瘟和非洲猪瘟的引物和探针最佳浓度比例做了优化，确保两套引物探针在同一个体系中发挥最佳作用。在特异性试验中，能够将猪瘟和非洲猪瘟同口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪水泡病病毒及圆环病毒２型区分开，说明本研究所建立的多重荧光ＰＣＲ方法可以将猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒同猪类易感的其他病毒区分开。李维彬等［７］在ＴａｑＭａｎ探针检测非洲猪瘟方法中报道该方法可以检测到１００个拷贝数，重复试验中变异系数在２．１３％~３．６２％之间。张倩［８］在非洲猪瘟病毒和古典猪瘟病毒双重荧光ＰＣＲ检测方法中报道该研究可以检测到非洲猪瘟的１０个拷贝数、猪瘟的１００个拷贝数。本实验中建立的方法对猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的检测底限都可以达到１０拷贝数的数量级，而且方法稳定，变异系数均小于３％。另外，Ｒｉｓａｔｔｉ等［９］报道，荧光ＰＣＲ方法能够于动物出现临床症状前３～５ｄ检测到猪瘟病毒，而且鼻腔拭子和扁桃体拭子的检出时间也早于血液样品。可见，采用正确部位的临床样品也是早期检测猪瘟病毒的关键。总之，本研究建立了可同时检测猪瘟和非洲猪瘟的多重荧光ＰＣＲ方法，灵敏度高，特异性强，有望在猪瘟和非洲猪瘟的病原普查、早期诊断以及防控措施中发挥作用。

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