草甘膦残留的酶联免疫分析方法的建立

潘熙萍,楼佳俊,张高精,张丽莎,施曼玲

摘要：通过碳化二亚胺法将草甘膦（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ＧＬＹ）分别与卵清蛋白（ＯＶＡ）和牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶联制备免疫原和包被原。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）检测表明，草甘膦与牛血清白蛋白和卵清蛋白的偶联比分别为１１∶１和９∶１。合成的免疫原作用新西兰大白兔制备出草甘膦多克隆抗体，ＥＬＩＳＡ检测抗体溶液效价为１∶１×１０７，该抗体不与草甘膦的结构类似物增甘膦和双甘膦起交叉反应。以此抗体建立了草甘膦间接竞争ＥＬＩＳＡ检测方法（ｃｉＥＬＩＳＡ），其线性范围为０．７８～１００ μｇ/ｍＬ，线性回归方程为ｙ＝１５．８５１ ０ ｌｎｘ＋７．７８０ ５，Ｒ２＝０．９９３ ８。草甘膦的检测限为ＩＣ１０＝１．１５ μｇ／ｍＬ，ＩＣ５０＝１４．３５ μｇ／ｍＬ。在添加回收试验中，草甘膦添加值５和１０ μｇ／ｇ时，玉米粉中的草甘膦回收率为１０４．１２％和８１．３７％，小麦粉中的回收率则分别为１１８．９４％和为１０９．３９％。结果表明，采用所制备的多克隆抗体而建立的草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ方法可有效地应用于玉米粉和小麦粉中草甘膦的残留检测。

关键词：草甘膦（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ＧＬＹ）；多克隆抗体；间接竞争酶联免疫吸附法

中图分类号：Ｓ４８２．４文献标识码： Ａ文章编号：0439－８114（２０12）05－1002-04

Establishment ｏf ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Assay for Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ

ＰＡＮ Ｘｉ－ｐｉｎｇ，ＬＯＵ Ｊｉａ－ｊｕｎ，ＺＨＡＮＧ Ｇａｏ－ｊｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ－ｓｈａ，ＳＨＩ Ｍａｎ－ｌｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｄｉｉｍｉｎｅ ｃａｒｂｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ａｎｄ ｃｏａｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｂｅｉｎｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ） ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｈａｐｔｅｎ ｔｏ ＢＳＡ ａｎｄ ＯＶＡ ｗｅｒｅ １１∶１ ａｎｄ ９∶１ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ-ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）． Ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ． Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗａｓ １∶１×１０７ ｂｙ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ）． Ｔｈｅ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｇｌｙｐｈｏｓｉｎｅ ａｎｄ Ｎ－（Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｙｌ） ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ． Ａｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ （ｃｉＥＬＩＳＡ） ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ （ＩＣ１０） ｏｆ １．１５ μｇ／ｍＬ ａｎｄ ａ ｌｉｎｅａｒ ｗｏｒｋｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．７８～１００ μｇ ／ｍＬ ｗｉｔｈ ａｎ ＩＣ５０ ｖａｌｕｅ ｏｆ １４．３５ μｇ/ｍＬ． Ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｗａｓ ｙ＝１５．８５１ ０ ｌｎｘ＋７．７８０ ５，Ｒ２ ｗａｓ ０．９９３ ８． Ｗｈｅｎ ５ ａｎｄ １０ μｇ／ｇ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｅｘｅｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗｅｒｅ １０４．１２％ ａｎｄ ８１．３７％ ｉｎ ｃｏｒｎ ｍｅａｌ ｓａｍｐｌｅｓ， ｗｈｉｌｅ １１８．９４％ ａｎｄ １０９．３９％ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｆｌｏｕｒ ｂｌａｎｋ ｓａｍｐｌｅｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｉＥＬＩＳＡ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｃｏｒｎ ｍｅａｌ ａｎｄ ｗｈｅａｔ ｆｌｏｕｒ ｓａｍｐｌｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ； ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ； ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ

草甘膦（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ＧＬＹ）化学名为Ｎ－（膦酸甲基）甘氨酸，是一种非选择性广谱除草剂，是当前世界上应用最广、生产量最大的除草剂，也是目前我国使用量最大的除草剂［１］。先前的研究表明草甘膦对哺乳动物急性毒性低，且在生物体内不易积累，故对人类和其他哺乳动物不会产生明显危害［２］。但是，近年越来越多的研究表明草甘膦对哺乳动物发育、繁殖和内分泌系统都会产生一定的负面影响［３－６］。

草甘膦进入环境会对生态环境产生有害影响，并通过在食物中的残留对人类健康构成威胁。目前，《食品中农药最大残留限量》明确规定了草甘膦在稻谷、小麦、小麦粉、全麦粉、玉米、水果、甘蔗和棉子油中的最大残留限量。２００６年颁布的国家《生活饮用水卫生标准》也增加了对草甘膦的检测要求。

目前有关食品中草甘膦残留分析方法主要采用液相色谱和气相色谱法，另外还有液－质联用、气－质联用和离子色谱法等［７］。但由于草甘膦极性强，易溶于水，难溶于大多数有机溶剂，没有发色和荧光基团等特性，使得液相色谱法需要各种衍生技术的使用。此外，草甘膦与自然界存在的氨基酸和氨基糖的相似性，也使采用色谱法测定谷物与动物产品中的草甘膦残留更加困难，必须借助于繁琐的离子交换柱净化程序，但实验操作复杂，难度大，无法满足草甘膦快速检测的需要。因此，研制草甘膦残留的快速检测方法，加强食品和环境中草甘膦残留的检测与监控，对保障人类健康具有重要意义。本研究制备了草甘膦的多克隆抗体，并建立了快速灵敏的草甘膦间接竞争ＥＬＩＳＡ（ｃｉＥＬＩＳＡ）检测方法，为进一步研制免疫检测试剂盒奠定基础。

１材料与方法

１．１材料和仪器

草甘膦标准品纯度＞９９％，购自德国Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ公司；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、卵清蛋白（ＯＶＡ）、辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记羊抗兔抗体（酶标二抗）、弗氏完全佐剂（ＦＣＡ）、弗氏不完全佐剂（ＦＩＡ）均购自Ｓｉｇｍａ公司；其他化学试剂为国产分析纯。新西兰雄性大白兔购自杭州师范大学动物中心。主要仪器设备包括ＢＩＯ－ＲＡＤ ６８０型酶标仪，Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ型基质辅助激光解析飞行时间质谱仪（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ，美国Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ公司）。

１．２草甘膦包被原和免疫原的制备与鉴定

草甘膦包被原ＧＬＹ－ＢＳＡ和免疫原ＧＬＹ－ＯＶＡ的制备方法参照文献［８］。通过ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ质谱仪测定ＧＬＹ与ＢＳＡ以及ＧＬＹ与ＯＶＡ偶联前后分子质量的变化，以判断偶联是否成功，并计算偶联比。

１．３草甘膦多克隆抗体的制备及纯化

２ ｍL免疫原ＧＬＹ－ＯＶＡ与等体积弗氏完全佐剂乳化后，采用背部皮下和腋窝多点注射的方法免疫新西兰大白兔。２周后，２ ｍｇ ＧＬＹ－ＯＶＡ与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后注射免疫，免疫方法同上。之后每间隔１周加强免疫１次，兔子耳静脉采血测定抗体效价。最后一次免疫剂量加倍，免疫后７ ｄ颈部采血，血样在室温下静置凝结３０ ｍｉｎ后，４ ℃下过夜，次日离心取上清分装后于－２０ ℃保存。采用饱和硫酸铵盐析法纯化抗血清溶液，纯化后抗体溶液分装置于－８０ ℃保存。

１．４草甘膦多克隆抗体的鉴定及效价测定

用间接ＥＬＩＳＡ法进行草甘膦多克隆抗体鉴定及抗体效价测定，具体步骤如下：①包被。分别以ＯＶＡ、ＢＳＡ、ＧＬＹ－ＢＳＡ为包被原，倍比稀释后加入酶标板中，１００ μＬ／孔，４ ℃过夜；洗涤３次，每次间隔３ ｍｉｎ，拍干。②封闭。加入５ ％ 脱脂奶粉封闭，２００ μＬ／孔，３７ ℃孵育１ ｈ，拍干。③加一抗。加入倍比稀释的草甘膦抗体１００ μＬ，３７ ℃温育１ ｈ，洗涤同上。④加酶标二抗。加入１∶１０ ０００ 稀释的羊抗兔酶标二抗，１００ μＬ／孔，３７ ℃孵育１ ｈ，洗涤同上。⑤显色。加入ＴＭＢ底物显色液，１００ μＬ／孔，３７ ℃显色１５ ｍｉｎ。⑥终止读数。加入２ ｍｏｌ／Ｌ的硫酸终止显色反应，５０ μＬ／孔，用酶标仪测定其ＯＤ４５０nm值。设置阴性对照，以ＯＤ值Ｐ／Ｎ＞２．１为阳性判断标准。

１．５间接竞争ＥＬＩＳＡ（ｃｉＥＬＩＳＡ）检测方法的建立

分别将包被原ＧＬＹ－ＢＳＡ和草甘膦多克隆抗体溶液倍比稀释，进行间接ＥＬＩＳＡ方阵实验，选取ＯＤ４５０nm值在１．０左右的包被原和抗体浓度为最适工作浓度。建立ｃｉＥＬＩＳＡ检测方法，实验步骤如下：以最适工作浓度的ＢＳＡ－ＧＬＹ为包被原包被酶标板，４ ℃过夜，洗涤，封闭；１００ μＬ草甘膦标准品溶液与等体积最适工作浓度的草甘膦抗体混合，设置空白对照和不抑制对照，３７ ℃孵育４０ ｍｉｎ，然后转移到封闭好的酶标板中，１００ μＬ／孔，３７ ℃孵育４０ ｍｉｎ，洗涤。后续实验步骤如加酶标二抗、显色和终止读数同１．４中方法。

１．６标准曲线的绘制

分别配制０．７８、１．５６、３．１２、６．２５、１２．５０、２５．００、５０．００和１００．００ μｇ／ｍＬ的草甘膦标准品溶液，采用ｃｉＥＬＩＳＡ法测定不同浓度的草甘膦标准品对抗体与包被原结合的抑制率，抑制率按文献［９］中的公式进行计算。以草甘膦各标准品溶液的对数浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，绘制标准曲线。以ＩＣ５０来衡量抗体对草甘膦的亲和力，以ＩＣ１０为该ＥＬＩＳＡ方法的检测灵敏度指标。

１．７草甘膦多克隆抗体的特异性测定

采用ｃｉＥＬＩＳＡ法，分别测定草甘膦多克隆抗体与草甘膦结构类似物双甘膦、增甘膦的交叉反应率，根据交叉反应率高低鉴定抗体的特异性。交叉反应率的计算公式如下：

交叉反应率＝（ＧＬＹ的ＩＣ５０／ＧＬＹ类似物的ＩＣ５０）×１００％。

１．８添加回收试验

取１ ｇ空白样品（小麦粉和玉米粉）溶于水，添加草甘膦标准品，使样品的浓度为５和１０ μｇ／ｇ。添加回收试验方法参照文献［９］，并计算添加回收率。

２结果与分析

２．１草甘膦包被原与免疫原的制备与鉴定结果

通过碳化二亚胺法将ＧＬＹ分别与ＢＳＡ和ＯＶＡ偶联，偶联物通过ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ质谱仪测定分子质量，结果见图１和图２。质谱检测表明２个偶联物ＧＬＹ－ＢＳＡ和ＧＬＹ－ＯＶＡ的分子质量分别为６９ ０４０．１ u和５３ ６２６．９ u，与ＢＳＡ的６７ ２２９．２ u和ＯＶＡ的５２ １７０．２ u的分子质量差异明显，说明偶联成功。计算得出１分子ＢＳＡ与１１分子的ＧＬＹ偶联，１分子ＯＶＡ与９分子的ＧＬＹ偶联，即ＧＬＹ与ＢＳＡ、ＧＬＹ与ＯＶＡ的偶联比分别为１１∶１和９∶１。

２．２草甘膦多克隆抗体的纯化、鉴定及效价测定结果

采用饱和硫酸铵法对获得的草甘膦抗血清进行纯化，紫外分光光度计测定纯化后的多抗溶液浓度为３．６８ ｍｇ／ｍＬ。间接ＥＬＩＳＡ检测表明所制备的草甘膦多抗与ＧＬＹ－ＢＳＡ呈阳性反应。该试验结果证实了通过免疫、纯化等实验过程已成功获得草甘膦多克隆抗体。间接ＥＬＩＳＡ方法测得草甘膦多抗溶液效价为１∶１×１０７。

２．３ｃｉＥＬＩＳＡ检测方法的建立

包被原原始浓度为１．２１ ｍｇ／ｍＬ，将包被原和草甘膦多抗分别倍比稀释，利用间接ＥＬＩＳＡ进行方阵试验，考虑到实际应用时要求有较高的检测灵敏度，并尽可能减少非特异性反应，确定ｃｉＥＬＩＳＡ分析方法中包被原与草甘膦多抗的最适工作浓度为：包被原稀释倍数为２．０×１０４，草甘膦多抗稀释倍数为４．０×１０３。

２．４标准曲线的绘制

采用ｃｉＥＬＩＳＡ法检测，并根据公式计算不同浓度的草甘膦对抗体的抑制率。以草甘膦标准品溶液的对数浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制草甘膦标准曲线（图３），表明草甘膦在０．７８～１００ μｇ／ｍＬ范围内，抑制率与浓度呈线性关系，线性回归方程为ｙ＝１５．８５１ 0 ｌｎｘ＋７．７８０ ５，Ｒ２＝０．９９３ ８，ＩＣ５０＝１４．３５ μｇ/ｍＬ，ＩＣ１０＝１．１５ μｇ／ｍＬ，即抑制率为１０％时草甘膦的检测限为１．１５ μｇ／ｍＬ。

２．５ 草甘膦多克隆抗体的特异性测定结果

通过ｃｉＥＬＩＳＡ法检测、计算出草甘膦多抗与草甘膦及类似物的交叉反应率，结果见表１。草甘膦多抗与双甘膦和增甘膦的交叉反应率均小于０．０１％，而与草甘膦的交叉反应率为１００％，说明所制备的草甘膦多抗具有较高的特异性。

２．６添加回收试验结果

选择ＧB２７６３－２００５所规定的草甘膦残留检测的两种农产品小麦粉和玉米粉的空白样品，进行草甘膦添加回收试验，结果见表２。草甘膦添加值为５ μｇ／ｇ和１０ μｇ／ｇ时，玉米粉中的回收率分别为１０４．１２％和８１．３７％；小麦粉中的回收率则分别为１１８．９４％和１０９．３９％。试验结果表明，采用所制备的多克隆抗体建立的草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ方法，可有效地应用于玉米粉和小麦粉中草甘膦的残留检测。

３小结与讨论

以抗原抗体的特异性反应为核心的酶联免疫吸附技术是近年来发展最快的微量检测技术，广泛应用于农产品中农药、抗生素等残留的检测［１０］。酶联免疫吸附技术具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备和人员素质要求低以及样品前处理简单等优点，适于现场监测和大规模样品筛选［１１］，ＥＬＩＳＡ技术也为草甘膦残留分析提供了新方法，Ｃｌｅｇｇ等［８］制备了兔抗草甘膦多克隆抗体，建立了草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ检测方法，检测限达７．６ μｇ／ｍＬ。本研究利用抗血清制备技术获得了高特异性的草甘膦多克隆抗体，间接ＥＬＩＳＡ检测结果表明草甘膦多抗效价为１∶１×１０７。采用所制备的多克隆抗体建立的草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ方法，其检测草甘膦的线性范围为０．７８～１００ μｇ/ｍＬ，检测限ＩＣ１０为１．１５ μｇ/ｍＬ，比Ｃｌｅｇｇ等报道的低，因而检测更灵敏，可有效地应用于小麦粉和玉米粉中的草甘膦残留检测。草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ检测方法的建立，为进一步开发免疫检测试剂盒奠定了基础，并为食品和环境中草甘膦残留的监控提供便捷、快速和灵敏的检测方法。

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