鹅巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗的研制

王学理,鄢长庆,刘珂飞,杨明,杨明霞

摘要：为了有效控制霍尔多巴吉鹅巴氏杆菌病（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ）的发生，将内蒙古通辽地区分离鉴定的巴氏杆菌作为菌种，采用液体增菌培养后灭活，加入佐剂制成油乳剂灭活疫苗，经无菌和安全检验合格后免疫２０日龄雏鹅（０．５ ｍＬ／只）。结果表明，该疫苗免疫效果良好，１次免疫后保护率达７３．３％，２次免疫后保护率达９６．７％。

关键词：巴氏杆菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）；霍尔多巴吉鹅；疫苗

中图分类号：Ｓ８５８．２９９；Ｓ８５２．４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）05－0965-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｏｉｌ－ａｄｊｕｓｔ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｏｏｓｅ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ mｕｌｔｏｃｉｄａ

ＷＡＮＧ Ｘｕｅ－ｌｉ１，２，ＹＡＮ Ｃｈａｎｇ－ｑｉｎｇ２，ＬＩＵ Ｋｅ－ｆｅｉ２，ＹＡＮＧ Ｍｉｎｇ２，ＹＡＮＧ Ｍｉｎｇ－ｘｉａ１

（１． Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｔｏｎｇｌｉａｏ ０２８０４２， Inner Mongolia，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｔｉａｎｊｉｎ Ｓｈｅｎｇｊｉ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００３８４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｏｌｚｅｒ ｂｕｇｇｙ ｇｏｏｓｅ， ｔｈｅ ｏｉｌ－ａｄｊｕｓｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｏｆ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｔｏｎｇｌｉａｏ ｗａｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｔｏ ２０－ｄａｙ－ｏｌｄ Ｈｏｌｚｅｒ ｂｕｇｇｙ ｇｏｏｓｅ at ａ ｄｏｓｅ ｏｆ ０．５ ｍＬ ａｆｔｅｒ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｗａｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｗｉｔｈ a ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ７３．３％ ａｆｔｅｒ ｉｎｉｔｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ９６．７％ ａｆｔｅｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ； Ｈｏｌｚｅｒ ｂｕｇｇｙ ｇｏｏｓｅ； vａｃｃｉｎｅ

鹅巴氏杆菌病（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ）是由禽多杀性巴氏杆菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）引起的一种鹅的急性、败血性、高度接触性传染病。常引起鹅的急性败血症及组织器官出血性炎症，其特征是高热、下痢、呼吸困难［１］。巴氏杆菌血清型较多，采用药物防控效果比较好，但停药一段时间又复发，造成经常用药，易产生抗药性，增加饲养成本，故疫苗的免疫接种是预防该病的一种较好的办法。本研究旨在探讨霍尔多巴吉鹅内蒙古通辽地区巴氏杆菌分离株油乳剂灭活疫苗的制备和对鹅的免疫保护效果，为该病的预防提供一种方法。

１材料与方法

１．１病料

２０１１年８月中旬，内蒙古通辽某养殖场送检的霍尔多巴吉商品鹅病、死鹅。

１．２菌株分离鉴定

１．２．１分离培养将肝、肺、脾等病料无菌接种于鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板，３７ ℃培养１８～２４ ｈ，挑取单个菌落，进行纯培养并鉴定。

１．２．２菌株鉴定挑取上述纯培养菌落抹片，瑞氏、美蓝和革兰氏染色，镜检。

１．２．３细菌生化试验将纯化好的疑似巴氏杆菌菌株分别接种于尿素、精氨酸、明胶、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、乳糖、肌醇、菊糖、ＭＲ、Ｖ－Ｐ、Ｈ２Ｓ、石蕊牛乳等生化培养基，３７ ℃培养２４～４８ ｈ，观察结果，同时与标准菌株进行比较。

１．３动物试验

用灭菌生理盐水与病死鹅肝、脾组织研磨，制成１０％悬液，接种于１０只小白鼠皮下，每只０．２ ｍＬ，观察小鼠死亡时间，取鼠肝、脾等脏器涂片染色，镜检。

１．４巴氏杆菌悬液的制备与灭活

选定菌株接种于血液琼脂培养基上，３７ ℃培养１８ ｈ，挑取培养物接种于马丁肉汤（含０．１％血红素，１．０％血清）培养基中，３７ ℃振荡培养１８ ｈ，纯度检查后作为种子液。然后将合格的种子液按照１０％的比例再接种于制苗用的马丁肉汤中，３７ ℃振荡培养２４ ｈ，收集菌液。在培养过程中每４ ｈ振摇１次，菌液培养经纯度检查合格后计数，保证含菌量达到２．５×１０１０ ＣＦＵ／ｍＬ。再向菌液中均匀加入０．３％的甲醛，３７ ℃灭活４８ ｈ。菌液灭活后再取样接种于血液琼脂培养基上，观察是否有细菌生长。

１．５巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗的制备

将灭活菌液加入２％吐温－８０为水相，油相为９２％白油、６％司班－８０和２％硬脂酸铝，混合均匀。然后将油相与水相按体积比３∶１的比例混合，经高速组织匀浆机充分乳化后备用。

１．６巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗的质量检验

１．６．１无菌检验取油佐剂灭活疫苗接种于血液琼脂培养基，观察细菌生长情况。

１．６．２黏度检验采用流出法观察油佐剂灭活疫苗从取液器吸管自然流出的时间。

１．６．３稳定性检验采用离心加速分层法，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，观察液体分层情况。

１．６．４安全检验选择８只２周龄健康的霍尔多巴吉雏鹅，颈部皮下注射制备好的疫苗１．０ ｍＬ／只，连续１５ ｄ观察试验鹅注射部位、采食及精神状况。

１．７巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗免疫效果观察

将２０日龄健康霍尔多巴吉雏鹅９０只随机分成３组舍饲，第１组：２０日龄皮下接种疫苗，剂量为０．５ ｍＬ／只，分别在２７、３０、３５日龄时各取１０只攻毒，观察发病情况。第２组：２０日龄时第一次皮下接种疫苗，剂量为０．５ ｍＬ／只，３０日龄时按相同方法和剂量第二次免疫，然后分别在３７、４０、４５日龄时各取１０只攻毒。第３组：为对照组，分别于２０、３０日龄时每只皮下注射无菌生理盐水０．５ ｍＬ，然后在３７、４０、４５日龄时分别取１０只攻毒。攻毒方法均为颈部皮下注射鹅巴氏杆菌菌液０．４ ｍＬ／只。

２结果

２．１临诊及剖检结果

鹅群突然发病，３ ｄ内死亡率达３５％。送检病鹅肉髯肿大发绀，粪便呈黄绿色或水样混有血液的稀便，从口、鼻中流出黏液，呼吸困难。有的发生关节肿胀，表现跛行或行走不便，后期发生瘫痪。剖检咽喉部有大量分泌物，肝脏肿大、质脆，表面有针尖大小的出血点和灰白色坏死灶，十二指肠黏膜发生严重的出血性炎症，胆囊肿大，心内、外膜有出血斑，肺脏出血，呼吸道黏膜呈环状充血，皮下组织及腹部脂肪有针尖大出血点。

２．２菌株分离鉴定结果

分离菌株在麦康凯培养基上不生长；鲜血琼脂培养基上长出圆形隆起、湿润、边缘整齐、灰白色、中等大小的菌落，并有荧光性。用碱性美蓝或瑞氏染色液染色，显微镜检查可见大小为（０．２～０．４）μｍ×（０．５～２．５）μｍ的卵圆形、典型两极着色的小球杆菌，单个或成双排列，无芽孢；革兰氏染色镜检为阴性。

用血平板上分离出的菌株进行生化试验。结果显示，该菌不能分解尿素和精氨酸，不液化明胶；同时，该菌可以分解果糖、半乳糖、蔗糖、葡萄糖和甘露醇，产酸不产气；对鼠李糖、肌醇、菊糖、乳糖不能分解，ＭＲ、Ｖ－Ｐ、石蕊牛乳试验均为阴性，Ｈ２Ｓ试验阳性。

２．３动物试验结果

１０只小白鼠均于接种后１８ ｈ内死亡。剖检可见接种部位皮下组织出现水肿，心包和胸腔有浆液性、纤维素性渗出物，心内外膜出血，肝脏、淋巴结肿大。取心血接种于鲜血琼脂培养基上作培养，置３７ ℃培养２４ ｈ有细菌生长，菌落形态及涂片染色特点同“2.2”。

２．４巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗的质量检验

无菌检验表明，该疫苗在血液琼脂培养基上无菌落生长，灭活效果良好；在室温下随机取１ ｍＬ疫苗从取液器吸管自然流出时间约４ ｓ，符合油佐剂疫苗的黏度要求（４～６ ｓ）；将制备的疫苗滴于蒸馏水表面，油滴呈规则圆形，保持１５ ｍｉｎ以上不扩散；３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，疫苗无分层现象，稳定性良好。

将疫苗接种于８只２周龄健康霍尔多巴吉雏鹅，连续１５ ｄ观察，未见不良反应，所有试验鹅全部存活；剖检试验鹅，注射部位未见肿胀、化脓等异常表现，表明疫苗具有较高的安全性。

２．５巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗的免疫保护效果

由表１可见，１次免疫后平均保护率为７３．３％，２次免疫后平均保护率为９６．７％，疫苗免疫效果良好。

３讨论

巴氏杆菌广泛存在于自然界和畜禽体内。因此该病有自体感染和外源性感染。正常存在于多种健康动物的口腔和咽部黏膜，当动物抵抗力下降时，细菌侵入体内，大量繁殖并致病，发生内源性传染。致病因素常为气候变化、营养、损伤、兴奋、饲养管理和潜伏性疾病等。因此，平时应加强饲养管理，严格卫生消毒制度，鹅粪应及时清理，病、死鹅应焚烧或深埋处理。每天供给新鲜清洁的饲料，并根据不同的生长发育阶段，补充适当的精料，掌握“单一饲养，全进全出”两个生产管理原则［２］。

从免疫效果来看，本试验制备鹅巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗在一免后７ ｄ有６０％的保护率，１０ ｄ和１５ ｄ后均有８０％的保护率。而二免７ ｄ后就能产生较好的免疫力。霍尔多巴吉商品鹅一般６０ ｄ左右出栏，因而对该品种商品鹅选择两次免疫可有效抵抗巴氏杆菌对机体的感染。

近年来，鹅巴氏杆菌病时有发生［３－５］，并且耐药性逐渐增强。目前，许多中小型水禽养殖户疫苗免疫意识淡薄、随意使用抗生素，结果导致该病发病率和死亡率逐渐攀升，病原耐药谱越来越广。因此，养殖户除了要具备良好的饲养管理条件，疫苗的免疫和抗生素的合理使用也尤为重要。霍尔多巴吉鹅是匈牙利的一个优良品种，因具有增重快、肉质鲜嫩、蛋白质含量高、低脂肪、低胆固醇、营养价值高以及产毛多等优点而备受青睐，我国很多地区已大范围推广养殖。巴氏杆菌血清型众多，各地区存在一定的差异，在对该品种进行疫苗免疫时，要根据当地鹅疫情的发展变化制定适合本场的免疫程序，最好采用与致病菌抗原性相一致的巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗进行免疫，才能取得事半功倍的效果。

参考文献：

［１］ 许英民．自家组织苗在防控种鹅巴氏杆菌病上的应用［Ｊ］．兽医导刊，２００７（１２）：３６－３７．

［２］ 陈桂先，邓玉英． 一起鹅巴氏杆菌病的诊治与体会［Ｊ］．养禽与禽病防治，２００８，２７（４）：４２－４３．

［３］ 王彩丽，匡红艳，荣俊，等．多杀性巴氏杆菌ＰＣＲ检测方法的建立［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医（科技版），２０１１（８）：１２９－１３０．

［４］ 张佰娣，陆伟． 吉林地区鹅巴氏杆菌病病原分离鉴定及药敏试验［Ｊ］．畜牧兽医科技信息，２００８（１２）：２８－２９．

［５］ 孙红军，王春香．鹅巴氏杆菌病的诊断及防治措施［Ｊ］．养殖技术顾问，２００９（１０）：９９．