指纹图谱技术在云南省烤烟质量分类中的应用研究

2012-04-29唐徐红矣跃平袁仕信何云燕刘磊尹晓东曹林海何结望李琳涂书新

湖北农业科学 2012年6期

唐徐红矣跃平袁仕信何云燕刘磊尹晓东曹林海何结望李琳涂书新

摘要：选择合适的方法对烟叶质量进行科学合理的分类，对于指导烤烟配方打叶工作及提高卷烟质量具有重要意义。试验采用高效液相色谱指纹图谱技术，结合化学计量学分析方法，建立了云南省１５个典型烟叶产区Ｃ３Ｆ等级烟叶基于指纹图谱特征的烟叶质量分类方法。结果表明，２０１０年收获的云南省典型烟叶产区的烟叶质量可分成４个基本类型，一类产区包括富源县、沾益县、马龙县和大姚县，二类产区包括宣威市、禄劝县、保山市、丽江市和景东县，三类产区包括麒麟区、罗平县、红河县和文山县，四类产区包括临沧市和昭通市。试验研究结果显示，烟叶指纹图谱作为烟叶质量控制的新方法，可以减少评吸师的工作量，提高配方打叶的工作效率。

关键词：指纹图谱；烤烟；品质；分类；云南省

中图分类号：Ｏ６５７．７＋３；Ｓ５７２；ＴＳ２０７．７（２７４）文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）06－1156-05

Application of Fingerprint Technology in Quality Classification of Flue-Cured Tobacco in Yunnan Province

ＴＡＮＧＸｕ－ｈｏｎｇ１，ＹＩＹue－ｐｉｎｇ２，ＹＵＡＮＳｈｉ－ｘｉｎ２，ＨＥＹｕｎ－ｙａｎ２，ＬＩＵＬｅｉ２，ＹＩＮＸｉａｏ－ｄｏｎｇ２，ＣＡＯＬｉｎ－ｈａｉ１，

ＨＥＪｉｅ－ｗａｎｇ３，ＬＩＬｉｎ３，ＴＵＳｈｕ－ｘｉｎ１

（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＹｕｎｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅＣｏｍｐａｎｙｏｆＴｏｂａｃｃｏ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２１８，Ｃｈｉｎａ；３．ＴｏｂａｃｃｏＩｎｄｕｓｔｒｙＣｏ．，Ｌｔｄ．ｏｆＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｗｕｈａｎ４３００５１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄｒａｔｉｏｎａｌｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ flue-cured ｔｏｂａｃｃｏｑｕａｌｉｔｙｗａｓｏｆｇｒｅａｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｆｏｒｇｕｉｄｉｎｇｏｆ flue-cured ｔｏｂａｃｃｏｌｅａｆｂｌｅｎｄｉｎｇｍｏｄｕｌｅｓａｎｄｉｍｐｒｏｖｉｎｇｑｕａｌｉｔｙｏｆｃｉｇａｒｅｔｔｅｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ａｑｕａｌｉｔｙｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆｔｏｂａｃｃｏｌｅａｖｅｓ，ｇｒａｄｅＣ３Ｆ，ｆｒｏｍ１５ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｒｅａｓｏｆＹｕｎｎａｎｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｍｅａｎｓｏｆＨＰＬＣｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｏｂａｃｃｏｑｕａｌｉｔｙｃｏｕｌｄｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ４ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅｆｉｒｓｔｃｌａｓｓｏｆａｒｅａｓｉｎｃｌｕｄed Ｆｕｙｕａｎｃｏｕｎｔｙ，Ｚｈａｎｙｉｃｏｕｎｔｙ，ＭａｌｏｎｇｃｏｕｎｔｙａｎｄＤａｙａｏｃｏｕｎｔｙ，ｔｈｅｓｅｃｏｎｄｃｌａｓｓｏｆａｒｅａｓｉｎｃｌｕｄed Ｘｕａｎｗｅｉｃｉｔｙ，Ｌｕｑｕａｎｃｏｕｎｔｙ，Ｂａｏｓｈａｎｃｉｔｙ，ＬｉｊｉａｎｇｃｉｔｙａｎｄＪｉｎｇｄｏｎｇｃｏｕｎｔｙ，ｔｈｅｔｈｉｒｄｃｌａｓｓｏｆａｒｅａｓｉｎｃｌｕｄed Ｑｉｌｉｎｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｌｕｏｐｉｎｇｃｏｕｎｔｙ，ＨｏｎｇｈｅｃｏｕｎｔｙａｎｄＷｅｎｓｈａｎｃｏｕｎｔｙ，ｔｈｅｆｏｕｒｔｈｃｌａｓｓｏｆａｒｅａｓｉｎｃｌｕｄed ＬｉｎｃａｎｇｃｉｔｙａｎｄＺｈａｏｔｏｎｇｃｉｔｙ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｅｗｍｅｔｈｏｄｃｏｕｌｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｗｏｒｋｌｏａｄｏｆｓｍｏｋｉｎｇｖａｌｕａｔｏｒａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｌｅａｆｂｌｅｎｄｉｎｇ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ；ｆｌｕｅ－ｃｕｒｅｄｔｏｂａｃｃｏ；ｑｕａｌｉｔｙ； classification；Ｙｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ

云南省具有種植烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）得天独厚的条件，生产出的烤烟色泽橘黄、香气浓郁、吸味醇和、品质优良，是中式卷烟的主体原料［１］。但是，由于云南省地理特征和气候变化较大，不同地区的烟叶风格存在着显著的差异；当地烟叶公司为了对烟叶质量进行控制，为卷烟生产企业提供更多的质量稳定的烟叶原料，需要在对烟叶质量进行合理分类的基础上实行烤烟配方打叶工作。

长期以来，烟叶品质的评价和分类是采用感官评吸和化学分析等方法进行的。然而，人工评吸工作量大，劳动强度高，且结果受主观因素影响大，重复性差，并不适合在大规模生产上应用。而常规化学成分检测通常是烟叶质量判断的辅助手段［２，３］，如钾氯比只能表明烟叶的燃烧性，施木克值只能描述烤烟和香料烟的吃味品质，糖酸比仅能反映烤烟的香气风格和香气品质，氮碱比反映烟气的浓度、吃味，糖碱比用来判断烟气的柔和性和香味。由于烟草是一种植物原料，化学成分非常复杂，烟叶香气品质中已鉴定的成分就高达５０００种以上。显然，单靠测定某一种或某些化学成分很难对烟叶质量进行有效的评价。

指纹图谱系指将分析对象经适当处理后，采用一定的仪器分析手段得到的、能够标示该对象特性的共有峰图谱。指纹图谱技术具有模糊指纹特征分析、宏观推断分析等特点，是进行复杂物质质量评价的有效手段［４，５］。指纹图谱技术已经被成功地应用于中药品质分析和判断及农产品溯源等领域。近年来，一些研究者对指纹图谱技术在烟草科研与生产上应用的理论和实践问题也进行了有益的探索［４－７］。课题组自２００５年以来一直开展应用烤烟指纹图谱技术判断烤烟品质的研究，并建立了烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱分析方法［８－１０］。

过去的研究证明了烤烟指纹图谱技术是解决烤烟品质评价复杂问题的有效手段，但烤烟指纹图谱技术应用于烤烟配方打叶质量控制的研究与应用尚未见报道。本研究的目的是在建立云南省不同品质烟叶的指纹图谱数据库的基础上，应用化学计量学的方法对指纹图谱进行表征，探讨指纹图谱技术在烤烟配方打叶中的应用途径和方法，从而为烤烟生产质量控制、烟叶生态类型划分和提高配方打叶的稳定性提供理论基础。

１材料与方法

１．１材料

供试烟叶品种为Ｋ３２６（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍＬ．ｃｖ．Ｋ３２６），等级为Ｃ３Ｆ，２０１０年分别取自云南省１５个不同的烟叶产区，包括富源县、沾益县、大姚县、马龙县、丽江市、麒麟区、禄劝县、红河县、临沧市、宣威市、景东县、罗平县、保山市、文山县、昭通市。所有烟样在２０１０年采样收集后，经云南省烟草烟叶公司统一复烤后制成烟丝。将烟丝样品在６０ ℃下烘干，用植物粉碎机粉碎，过６０目筛，将烟末用塑料袋密封，置于超低温冰箱（－８０ ℃）中保存待测。

１．２指纹图谱数据库的建立

称取０．６ｇ烟末，加入２０ｍＬ甲醇。在温度２５ ℃、频率为４０ＭＨｚ的超声波仪器中超声６０ｍｉｎ。离心机上离心（１００００ g）８ｍｉｎ，离心后取上清液过０．４５ μｍ的滤膜，取滤液为样品待测溶液。

采用ＡｇｉｌｅｎｔＯＤＳＣ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５ μｍ）色谱柱，流动相Ａ为乙腈，流动相Ｂ为０．１％甲酸。梯度洗脱程序：０ｍｉｎ，Ａ与Ｂ体积比０∶１００；３０ｍｉｎ，体积比４０∶６０；４５ｍｉｎ，体积比５０∶５０；５５ｍｉｎ，体积比６０∶４０，保持５ｍｉｎ；然后６５ｍｉｎ，体积比０∶１００，保持２ｍｉｎ后运行５ｍｉｎ。体积流量为５ｍＬ／ｍｉｎ，柱温２５ ℃，检测波长２５０ｎｍ。

１．３化学测定方法及数据统计分析

水溶性总糖及还原糖的测定采用文献［１１］的方法。烟碱的测定采用文献［１２］的方法。应用ＳＡＳ８．０软件进行主成分分析、简单相关分析、复相关分析，用类平均法进行聚类分析。采用Ｅｘｃｅｌ２００３软件进行做图分析。用中药色谱指纹图谱相似度评价系统Ａ版对指纹图谱进行相似度评价。

２结果与分析

２．１云南省烤烟的指纹图谱及其主成分分析

不同代表性的样品其指纹图谱数据有机联系放置在一起即构成指纹图谱数据库。图１是试验获得的云南省典型烟叶产区烤烟ＨＰＬＣ共有峰指纹图谱。根据共有峰确定原则，在不同产区C3F等级烟叶中确定的甲醇提取物指纹图谱共有４８个峰（数据未列）。

主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ cｏｍｐｏｎｅｎｔ aｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）是在信息量损失最小的情况下对数据进行压缩、通过线性变化从多个变量中选择数量较少的重要变量的过程。由于指纹图谱特征峰高达数百个，不便于进行化学计量学分析，因此试验利用主成分分析方法，设法将原来的变量重新组合成一组新的互相无关的若干个综合变量，同时根据实际需要从中取出几个较少的综合变量并能尽可能多地反映出原来变量的信息。试验将从指纹图谱分时数据库选取的１１组特征峰（分时特征峰的时间范围分别是０～３ｍｉｎ、３～６ｍｉｎ、９～１２ｍｉｎ、２１～２４ｍｉｎ、３６～３９ｍｉｎ、３９～４２ｍｉｎ、４２～４５ｍｉｎ、４８～５１ｍｉｎ、５１～５４ｍｉｎ、５４～５７ｍｉｎ、５７～６０ｍｉｎ）进行主成分分析，结果见表１和表２。从表１可见，前３个主成分的累计方差贡献率就已达到了９１．５0％，基本上能反映出指纹图谱包含的信息。因此将这３个主成分指标作为指纹图谱新的变量进行下一步的分析，从而达到降维的目的，这在很大程度上降低了数据分析的工作量。表２结果表明，主成分１的显著特征因子包括３、４、５、６、７、８、９、１０、１１组特征峰，主成分２的显著特征因子包括３、４组特征峰；主成分３的显著特征因子包括１、２组特征峰。

２．２云南省典型烟叶产区烤烟的化学品质

云南省１５个不同烟叶产区在２０１０年取样测定的C3F等级烟叶重要化学品质成分指标结果见表３，表中按烟叶烟碱含量从低到高排序，表３的结果表明，富源县、沾益县、大姚县和马龙县４个产区的烟叶烟碱含量处于云南省各产区的较低水平，烟碱含量在２％以下，而总糖、还原糖和糖碱比处于较高的水平，使得糖碱比在１８以上。与之相反，保山市、文山县和昭通市３个产区的烟碱含量处于较高水平，达３％以上，相应地，其总糖、还原糖和糖碱比处于较低水平，糖碱比在１０以下。其他产区的烟碱含量介于上述二者之间。

将主成分得分值与烟叶常规化学成分进行相关性分析，结果见表４。由表４可知，烟碱与主成分２呈极显著的正相关，与主成分３呈极显著的负相关，与主成分值之间的复相关达到了极显著水平；总糖含量与主成分１、主成分２呈显著的负相关，与主成分值之间的复相关达到了极显著水平；糖碱比与主成分１、主成分２呈极显著的负相关，与主成分３呈极显著的正相关，与主成分值之间的复相关达到了极显著水平。

２．３应用指纹图谱的聚类分析对云南省烤烟品质进行分类

以指纹图谱特征峰主成分值为参数，对云南省２０１０年１５个烟叶产区C3F等级烟叶样品进行聚类分析，结果见图２。图２表明，在距离值为０．１左右时，２０１０年云南省不同产区Ｃ３Ｆ等级烟叶可分成４类。第一类为麒麟区、丽江市、马龙县和大姚县；第二类是沾益县、富源县；第三类是临沧市、罗平县、红河县、景东县、禄劝县和宣威市；第四類是保山市、文山县、昭通市。

比较图２的聚类结果和表３的化学品质成分可以看出，聚类分析的结果与烤烟化学成分含量具有密切的联系，结合高效液相色谱指纹图谱技术与化学计量学分析方法，可建立云南省１５个典型烟叶产区Ｃ３Ｆ等级烟叶基于指纹图谱特征的烟叶质量分类方法。其中，一类产区包括富源县、沾益县、马龙县和大姚县，该产区烟碱含量范围是１．２７％～１．６３％，总糖、还原糖含量范围分别是２７．３２％～３６．１５％、２３．５４％～２８．７７％，糖碱比范围是１８．２７～２８．５３；二类产区包括宣威市、禄劝县、保山市、丽江市和景东县，该产区烟碱含量范围是２．０４％～２．２６％，总糖、还原糖含量范围分别是３０．３５％～３５．８７％、２４．２０％～３２．０３％，糖碱比范围是１３．８５～１７．６２；三类产区包括麒麟区、罗平县、红河县和文山县，该产区烟碱含量范围是２．２９％～３．００％，总糖、还原糖含量范围分别是２６．１１％～３２．０２％、２３．４７％～２５．９１％，糖碱比范围在１０．５５～１１．７７。四类产区包括临沧市和昭通市。该产区烟碱含量是３．５１％和３．９１％，总糖、还原糖含量范围分别是２０．８６％和２６．３３％、２０．２３％和２１．５６％，糖碱比是５．９５和６．６９。

３小结与讨论

不同品质或来源烟叶的差异性本质上来源于内在的化学成分组成或比例的不同。通过烤烟指纹图谱特征峰的定量比较，可以判断烟草品质及其来源。因此，指纹图谱技术可以直接用于烟叶质量控制的定量研究。由于指纹图谱分时特征峰仍是多元数据，在指纹图谱定量研究方面工作量比较大，也比较繁琐。从定量应用的角度考虑，需要有能够反映信息权重的综合指标值为代表，从整体上反映指纹图谱，而主成分分析法可以完成此类任务。试验通过指纹图谱主成分分析可以看出，前３个主成分的方差贡献率达到了９１．５0％，基本上能反映指纹图谱的总体信息。相关性分析显示，前３个主成分与烟叶中烟碱、总糖和糖碱比达到了显著或极显著的相关性，可见指纹图谱主成分可以用来对烟叶进行质量控制。类似的研究报道有，赫炎等［１３］采用主成分分析结合指纹图谱进行制南星饮片质量的控制方法；万益群等［１４］基于白酒ＨＰＬＣ指纹图谱，采用主成分分析、聚类分析和人工神经网络等统计方法，为白酒样品的鉴别提供了一个新的技术手段，也为白酒的质量控制提供了科学依据；刘江等［１５］通过麦冬ＨＰＬＣ指纹图谱进行主成分－聚类分析，建立的模式识别模型结果可靠，为麦冬质量评价和质量分类提供了有效依据。

聚类分析的基本思路是用“物以类聚”来衡量样品之间的亲疏程度，可广泛地用于各类物质包括中草药进行质量分类和鉴别［１６－１８］。试验通过指纹图谱特征峰聚类结果可以看出，不同类别之间烟叶的质量风格类型存在着显著的差别，同一类别之间烟叶中的化学成分稳定性较好。通过相同等级的指纹图谱再分级结果，可以使企业清楚了解烟叶的内在品质和等级结构，有利于从整体上设计配方，提高配方打叶的质量和纯度，且能充分有效地利用烟叶资源。

试验采用系统聚类方法［19］，对云南省典型烟叶产区烤烟HPLC指纹图谱分时数据库中选取的１１组特征峰多变量指标进行了聚类分析，其中距离的测定方法是类平均差法。结果显示，该方法可以将不同产区不同风格的烟叶进行有效的分类评价，能够客观反映烟叶的内在质量。不同产区之间的聚类结果表明，烟碱、总糖、还原糖和糖碱比等烟叶中化学品质成分指标在同一类别中结果相近，这将有效地降低因产区间气候条件带来的烟叶质量差异，从而提高配方打叶的稳定性。本研究还对不同年份、不同产区及不同等级烟叶的分类结果进行了比较（待发表），发现虽然产区内各年份烟叶由于气候条件和农艺措施导致烟叶质量出现变化，但通过对不同产地、不同部位烟叶的指纹图谱特征峰进行聚类分析和综合评价，可以找到在化学成分组成方面真正相近的烟叶，这将为配方打叶技术提供理论依据。

当然，指纹图谱技术在烟叶品质判断和分类的研究还处于起步阶段，指纹图谱数据库的应用还存在严重不足，对烤烟质量的评价还缺乏规范和统一的分析方法，这对指纹图谱技术在烟草业上的推广和应用构成了一定的障碍。指纹图谱包含的潜在信息量非常大，也包含有杂质或与指纹图谱研究无关的信息，因此信息的整理、滤除无用的信息、保留原始特征信息也是指纹图谱研究的难点和重点。指纹图谱具有模糊性和整体性的特性，对指纹图谱的评价应是对整体内容的综合性分析，但目前的研究缺乏一个综合的评价指标。另外，目前烤烟指纹图谱的特征峰对评吸指标和风格特点的影响研究较少。通过了解特征峰的作用和影响，将为特征峰的解析提供研究方向和目标。

采用主成分分析方法可将云南省典型烟叶产区烤烟HPLC指纹图谱分时数据库中１１组特征峰分成３个主成分，其特征方差贡献率总计达到了９１．５０％。指纹图谱技术包含有先进的仪器分析与信息技术，采用指纹图谱特征峰的聚类分析，可对不同产区烟叶的质量和风格进行分类。分类结果与烤烟化学成分指标，如烟碱、总糖和糖碱比具有密切的关系，这表明应用指纹图谱技术进行烤烟品质分类具有科学性和可操作性。

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