不同支架材料体外构建组织工程软骨的研究

葛平 王正辉 杨壮群 王瑞 温绣蔺

[摘要]目的：体外构建组织工程软骨，筛选更为适合组织工程软骨构建的支架材料。方法：体外获取SD大鼠肋软骨细胞。采用第一代软骨细胞作为种子细胞，接种于壳聚糖/明胶和BMG/生物蛋白胶支架，体外培养的不同时间对其进行HE、甲苯胺蓝染色、Masson染色、免疫学检测、扫描电镜观察。结果：在培养2周时，BMG/生物蛋白胶各种染色结果显示软骨细胞在其表面以及内部分布均匀，蛋白多糖和Ⅱ型胶原染色阳性；壳聚糖/明胶表面细胞稍多于前者，但内部细胞数量极少且分布不均，染色结果不如前者明显。随着培养时间的延长各种检测均显示有大量的软骨细胞特异性的蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达，壳聚糖/明胶凸显出明显的优势。结论：体外成功构建组织工程软骨，软骨细胞在BMG/生物蛋白胶上的生长、增殖和分泌基质情况优于壳聚糖/明胶支架。

[关键词]软骨细胞；组织工程；壳聚糖/明胶；BMG/生物蛋白胶

[中图分类号]R318[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）06-0941-04

组织工程概念的提出为修复软骨组织的缺损提供了一种新的思路和方法。在组织工程软骨的构建中，大量的生长状态良好的软骨细胞以及合适支架材料起着十分关键的作用。近年的研究表明多种生物材料均可用于组织工程软骨的构建，各种材料均有各自的优势和缺点。我们尝试将不同的材料进行复合，以弥补各自缺陷更好地构建组织工程软骨。本实验采用BMG/生物蛋白胶和壳聚糖/明胶支架材料复合第一代软骨细胞，筛选出更适合于构建组织工程软骨的支架材料。

1材料和方法

1.1 主要试剂与仪器：高糖DMEM培养基、胰蛋白酶（美国GIBCO公司）；透明质酸酶、Ⅱ型胶原酶（Sigma 公司）；胎牛血清（Invitrogen 公司）；Ⅱ型胶原一抗（小鼠抗大鼠，Neomarker 公司）；Aggrecan 单克隆抗体（羊抗大鼠，Santa Cruz 公司）；壳聚糖/明胶（天津中医药大学）；BMG（第四军医大学骨科）；生物蛋白胶（广州倍绣生物技术有限公司）；CO2 孵箱（Thermo 公司，美国）；荧光显微镜（Nikon,日本）。

1.2 实验方法

1.2.1 SD大鼠肋软骨细胞的培养[1]：SD 大鼠颈椎脱臼法处死，无菌操作台取其肋软骨组织，剥离软骨膜，用眼科剪剪至1mm3左右的组织块。采用三步法消化，获得软骨细胞, 37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养。传代培养采用0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA（比例为1:1）进行消化，25㎝2培养瓶接种密度为105/ml。本实验所采用的是第1代肋软骨细胞。

1.2.2 软骨细胞-支架复合物的构建

1.2.2.1 壳聚糖/明胶-软骨细胞复合物的构建：无菌操作条件下，将辐射灭菌的材料取出，置于24孔细胞培养板中。调整软骨细胞悬液浓度为1.0×107/ml，将50μl细胞悬液加入生物材料中（3mm×3mm×3mm），置于细胞培养箱中孵育4h，以使软骨细胞附着于生物材料和培养板，加入2ml含20%胎牛血清高糖 DMEM培养液，每天半量更换培养液，共培养8周。

1.2.2.2 BMG /生物蛋白胶-软骨细胞复合物的构建：将松质骨基质浸泡于DMEM培养液中5min后取出，用灭菌滤纸吸干附在松质骨基质表面和网眼内的水分，浸泡凝血酶后晾干。将纤维蛋白原主体胶与第 1代软骨细胞混合，制成1×107/ml的细胞悬液，向材料上滴入纤维蛋白原细胞悬液50μl，加入DMEM培养液200μl，静置于细胞培养箱内10min。将软骨模块全部移至在24孔培养板中加入2ml含20%胎牛血清高糖DMEM培养液，置于5%CO2恒温箱内培养，每天半量更换培养液，共培养8周。

1.2.3 组织学观察：分别于培养的不同时间点取出组织块，4%多聚甲醛固定，常规制作切片，行HE、甲苯胺蓝、Masson三色染色，光镜观察。

1.2.4 免疫学检测：培养8周的组织块4%多聚甲醛固定，Triton室温下浸泡25min，0.01mPBS洗3次，每次5min；滴加一滴3%H2O2（无色液体），消除内源性过氧化物酶活性。0.01m PBS洗涤3次，每次3min；滴加一滴工作用血清（试剂A），常温孵育15min，以消除非特异性染色；分别滴加（1:200）Ⅱ型胶原单克隆抗体、aggrecan抗体50μl，4℃冰箱过夜（>18h）；加入用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，培养箱内，孵育15min；0.01m PBS洗3次，每次5min；避光条件下于荧光显微镜下观察。

1.2.5 扫描电镜观察：取材培养2、4周的标本各一块,2.5%戊二醛固定,梯度乙醇脱水，干燥，送检扫描电镜观察支架材料表面软骨细胞的黏附以及软骨细胞的形态结构。

2实验结果

2.1 组织学观察结果：2周时可见软骨细胞在BMG/生物蛋白胶材料表面以及内部分布均匀，在壳聚糖/明胶材料表面分布的细胞稍多于BMG/生物蛋白胶，但内部的细胞明显少于材料表面（图1）。随着培养时间的延长，壳聚糖/明胶材料表面以及内部细胞数量逐渐增多， 8周时该材料表面可见大量层叠状软骨细胞存在，各种染色显示大量蛋白多糖和Ⅱ型胶原分泌。8周时BMG/生物蛋白胶处于降解阶段，材料连续性中断，软骨细胞数量及细胞外基质分泌量明显少于壳聚糖/明胶材料（图2）。

2.2 免疫荧光检测

2.2.1 蛋白多糖染色: 8周时可见壳聚糖/材料呈现黄绿色深染，周围为淡黄色或者黄绿色片染现象，与材料染色有明显差别，隐约可见软骨细胞形态（图3）。而BMG/生物蛋白胶材料为淡黄色或者绿色染色，在材料表面及内部软骨细胞分布及染色情况清晰可见。

2.2.2 Ⅱ型胶原染色： 8周时壳聚糖/明胶材料荧光染色可见黄绿色深染的为壳聚糖/明胶材料，呈皱折状，与HE染色形态一致，可明显辨认，周围为大量均匀分布的淡黄色或黄绿色片染现象为软骨细胞分泌特征性Ⅱ型胶原荧光染色情况，隐约可见细胞形态。BMG/生物蛋白胶材料荧光染色见软骨细胞分泌较多Ⅱ型胶原，染色为黄色或者黄绿色，但细胞数目明显少于壳聚糖/明胶材料，片状晕染现象不如后者明显（图3）。

2.3 电镜观察：2周时可见软骨细胞黏附于BMG/生物蛋白胶支架材料的表面，细胞单个存在，开始伸展，伪足比较明显（图4A）；而壳聚糖/明胶材料表面可见少量的软骨细胞黏附，细胞呈圆球形，各细胞之间接触不紧密，细胞之间没有细胞外基质的存在形态（图4B）。4周时可见：BMG/生物蛋白胶表面黏附有大量软骨细胞，但细胞伸展状态不佳（图4C）；壳聚糖/明胶材料表面黏附软骨细胞较少，细胞伸展状态良好，呈现为长梭形或者树枝状，可见明显的细胞周围突起伪足以及细胞核形态（图4D）。

3讨论

3.1 松质骨基质（BMG）经过脱钙、去脂、去蛋白等处理，去掉了除BMP以外 95%非胶原蛋白和有阻滞作用的脂质成分，降低了抗原性[2] ，同时松质骨基质还存留有少量BMP和其他促进骨软骨形成的内在生长因子[3]。但是单纯的松质骨基质对软骨细胞的吸附力并不强，软骨细胞不易附在其上，软骨细胞容易丢失，不易形成软骨组织。生物蛋白胶又称为纤维蛋白封闭剂，该物质具有可塑性强，生物相容性好的优点，为组织工程新软骨形成提供一种可选择的聚合物支架。Hommniga[4]等已经在实验中证实兔关节软骨细胞能在人纤维蛋白凝胶中分裂增殖、合成基质并保持其表型。纤维蛋白胶存在降解速度过快的缺点[5]，笔者尝试将BMG/生物蛋白胶进行复合，后能够弥补相互缺陷，更为符合组织工程材料的要求。

3.2 壳聚糖是一种源于动物的天然多糖，与细胞外基质的糖胺聚糖分子结构相似，具有很好的生物相容性[6]。壳聚糖带有正电荷，使得材料表面与细胞膜之间发生非特异性吸附，从而有利于细胞在材料表面的黏附[7]，且其降解产物对人体无毒副作用[8]。但由于单纯的壳聚糖材料亲水性较差、降解速度慢等原因，已很难满足组织工程的需要。许多学者尝试将壳聚糖材料与多种材料进行复合，均取得了较好的结果[9-11]。由于壳聚糖亲水性差，明胶可以促进细胞的黏附和生长，因此本研究考虑壳聚糖复合明胶，形成有利于细胞生长的细胞外基质层结构，可以促进细胞在材料表面的粘附和增殖。

3.3 体外培养8周后，可见两种材料表面以及内部均有蛋白多糖和Ⅱ型胶原的产生，提示在体外成功构建组织工程软骨。随着培养时间的延长，蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量逐渐增多，但壳聚糖/明胶材料更为明显，各种染色均显示其阳性染色强于BMG/生物蛋白胶材料组。而培养2周时，常规染色两种材料表面均有少量软骨细胞的黏附且细胞分布均匀，壳聚糖材料内部几乎看不到软骨细胞的存在，而BMG/生物蛋白胶材料内部可见少量软骨细胞呈圆形或者椭圆形均匀分布。分析其原因是由于软骨细胞先与主体胶溶液混合均匀，再与吸附于BMG/生物蛋白胶支架上的凝血酶发生作用，形成纤维蛋白胶，这样软骨细胞主要包埋在纤维蛋白胶内，均匀分布于BMG/生物蛋白胶支架表面以及网眼内，从而使软骨细胞有效地吸附和固定于支架内，不易丢失；采用滴加法将软骨细胞滴加在壳聚糖/明胶材料上，向材料内部的渗透作用较弱，软骨细胞主要分布于材料的表面。同时由于材料表面的氧气和营养比内部更充足，细胞更容易在壳聚糖/明胶材料表面生长，这与张世浩等[15]的研究一致。随着培养时间的延长，两种支架材料上细胞的数目均有显著增加，软骨细胞逐渐向材料内部生长，分布更为均匀。电镜观察BMG/生物蛋白胶表面细胞明显多于壳聚糖/明胶材料，可能是由于软骨细胞黏附于壳聚糖/明胶材料的表面，在电镜样品制作过程中很容易脱落；但细胞伸展状态不如壳聚糖/明胶材料，可能是生物蛋白胶材料降解速度过快，导致大量软骨细胞的丢失，细胞数量减少，细胞外基质分泌减少，使各细胞之间的连接、相互影响显著降低[11]。

3.4 软骨细胞在BMG/生物蛋白胶和壳聚糖/明胶材料上均能良好的生长，增殖。表明BMG/生物蛋白胶和壳聚糖/明胶材料均适合作为组织工程软骨的支架材料，但体外研究表明壳聚糖/明胶材料优于BMG/生物蛋白胶材料，其具体机制还需进一步进行体内实验。

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[收稿日期]2011-12-10[修回日期]2012-02-28

编辑/张惠娟