RP-HPLC测定拨云锭中龙胆苦苷的含量

袁文娟 高文分

摘 要：目的：建立拨云锭中龙胆苦苷含量测定方法。方法：采用Agilent ZORBAX SB C18柱（250 mm×46 mm,5 μm）为色谱柱，流动相：甲醇-水（30∶70），流速10 ml?min-1，检测波长：270 nm。结果：龙胆苦苷的线性范围为01624 μg ~16240 μg，r＝09999，平均加样回收率（n＝6）为9879%，RSD为057% 。结论：该方法简便快速、结果准确可靠，适用于拨云锭的质量控制 。

关键词：拨云锭；龙胆苦苷； RP-HPLC

中图分类号：R2841

文献标识码：A

文章编号：1007-2349（2012）06-0061-02

拨云锭是卫生部颁布的国家基本药物，由炉甘石（煅）、龙胆浸膏、冰片、麝香等10味中药组成，具有明目退翳，解毒散结，消肿止痛之功效。用于暴发火眼，目赤肿痛，痧眼刺痛，目痒流泪，翼状胬肉，白内障，牙龈肿痛，喉舌红肿［1］。适用于沙眼，睑缘炎，麦粒肿，急性结膜炎，慢性结膜炎，过敏性角膜炎，化脓性角膜炎，角膜云翳。有研究表明：拨云锭具有广谱抗菌作用，其中对金黄色葡萄球菌，白葡菌，甲、乙型链球菌的抗菌活力最强，低浓度呈较强的抑菌作用，高浓度呈现杀菌作用［2］。该药对动物的在体试验—家兔试验性角膜溃疡也呈现相同的作用［3］。拨云锭质量标准中缺少含量测定项，药品内在质量难以评定，本文建立了HPLC方法测定药品中龙胆苦苷的含量，为拨云锭的质量控制提供了科学依据。

1 仪器与试剂

Agilent1100高效液相色谱仪,带四元泵；VWD可变波长紫外检测器；自动进样器；在线真空脱气机；智能化柱温箱及HP化学工作站；甲醇为HPLC级，水为超纯水。龙胆苦苷对照品（中国药品生物制品检定所 含量测定用，批号：110770-200712）。六批拨云锭样品均由云南老拨云堂药业有限公司提供。

2 方法与结果

21 溶液的制备 对照品溶液：精密称取龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成 0050 mg?mL-1的对照品溶液。

供试品溶液：取重量差异项下的本品，研细，混匀，取约028 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理（功率250 W，频率33 KHz）15 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，取上清液，用微孔滤膜（045 μm）滤过，滤液作为供试品溶液。

阴性样品溶液：按处方比例制成不含龙胆浸膏的拨云锭阴性样品，按供试品溶液制备方法，制成阴性样品溶液。

22 色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18柱 (46×250 mm 5 μm)； 流动相：甲醇-水（30∶70）；流速：10 mL?min-1；柱温：30℃；检测波长：270 nm；进样量：10 μL；外标法。在此色谱条件下，龙胆苦苷与其它成分均能达到基线分离，拨云锭中的其它成分对龙胆苦苷的含量测定无干扰。结果见图1。

a 对照品；b 样品；c 阴性样品；1 龙胆苦苷

图1 拨云锭HPLC色谱图

23 线性关系考察 精密称取龙胆苦苷对照品适量，置量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再以甲醇稀释至一系列浓度的对照品溶液，按上述色谱条件分别进样10 μl，记录色谱图，以峰面积（Y）对进样量（X）作回归统计，得回归方程为Y=110793X+688，r= 09999（n=10），线性范围为01624 μg~16240 μg。

24 稳定性试验 精密吸取取供试品溶液分别在0，2，4，8，14 h进样，测得龙胆苦苷的峰面积， RSD为029％；表明样品溶液在14 h内基本稳定。

25 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μl，连续进样6次，测得龙胆苦苷的峰面积，其峰面积的RSD分别为038％。表明仪器的精密度良好。

26 重复性试验 精密称取同一批号拨云锭样品，平行制备6份供试品溶液，按“21”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别测定龙胆苦苷的含量， RSD为050％，表明方法的重现性较好。

27 加样回收率试验 取已知含量的拨云锭样品约014 g，精密称定，共6份，加入一定量的龙胆苦苷对照品溶液，挥干溶液，按“21”项下供试品溶液制备成加样回收率供试液，并依法测定，结果见表1。

表1 龙胆苦苷加样回收率试验结果（n＝6）

样品理论量

/mg 加入量

/mg 实测量

/mg 回收率

/％ 平均回收率

/％ RSD

/％

09976 1068 2055 98979

09897 1068 2046 98934

09828 1068 2033 98363 9879 057

09843 1068 2030 97876

09824 1068 2043 99292

09815 1068 2042 99314

28 含量测定 取不同批次的拨云锭样品，按供试品溶液的配制项下制备供试品溶液，每个批次的样品平行制备3份，分别测定龙胆苦苷的含量，结果见表2。

表2 拨云锭中龙胆苦苷的含量测定结果（n＝3）

批号 龙胆苦苷(mg/锭) RSD/%

20060601 1156 058

20061001 1033 064

20061002 1600 071

20061003 1694 039

20060602 1220 054

20060201 1284 026

29 检测限 取配制好的对照品溶液，用甲醇逐级稀释成一系列浓度，依次测定，至主峰与基线噪音峰高比约为3∶1，记录此时的色谱图及浓度，结果龙胆苦苷的检测限为538 ng。

3 讨论

31 检测波长的选择 试验采用紫外可见分光光度计对龙胆苦苷的甲醇溶液进行扫描，结果于270 nm与253 nm波长处有最大吸收。由于253 nm波长处的吸收度低于270 nm波长处的吸收，从检测灵敏度的角度考虑，选择270 nm作为本次试验的检测波长。

32 提取溶剂的选择 龙胆苦苷为裂环环烯醚萜苷类成分［4］，易溶于甲醇、水，可溶于乙醇。考察了不同浓度的甲醇、乙醇和水为溶剂的提取结果，结果表明纯甲醇的龙胆苦苷提取率最高。故选择纯甲醇作为提取溶剂。

33 提取方法的考察 龙胆苦苷为热不稳定性成分，研究表明超声法和冷浸法所制备的供试品溶液中龙胆苦苷的含量明显高于索氏提取法和热回流法［5］。本次试验分别考察了以甲醇为溶剂的两种提取方法，分别为冷浸法，超声法。这两种提取方法中龙胆苦苷的含量无显著性差别。考虑到超声法与冷浸法相比，超声法更简单，易行，快捷，故采用超声法，以甲醇为提取溶剂。此外，本次试验对超声时间进行了考察，依次测定了超声提取5 min、10 min、15 min、30 min以及60 min龙胆苦苷含量测定的结果。结果表明采用纯甲醇为溶剂，超声提取15 min时，龙胆苦苷成分提取完全。

34 流动相的选择 本次试验参照文献考察了以甲醇－水为流动相的系统［6］与以乙腈－水为流动相的系统［7］，结果表明，以甲醇－水（30∶70）为流动相，可是龙胆苦苷的分离度，理论塔板数、峰的对称性及出峰时间达到满意的结果。

本次试验建立的高效液相色谱法测定拨云锭中龙胆苦苷的含量，该法灵敏、快速、准确，可用于拨云锭的质量控制。

参考文献：

［1］卫生部药品标准第二十册盬S3—B—3875—98［S］. 1998：170

［2］王迪，郑英，陈金秀 拨云锭眼药对9种常见致病菌的体外抗菌作用观察［J］.眼科研究，2002，20（4）：365~366

［3］宋鹏 拨云锭对家兔实验性角膜溃疡的治疗效应［J］.现代应用药学，1989，（2）：1~2

［4］徐国钧，徐珞珊 中国药材学［M］. 北京：中国医药科技出版社，1996：365

［5］韩双，李玮，席先蓉 贵州不同地区坚龙胆中龙胆苦苷的含量测定［J］. 医药导报，2006，28（6）：783~785

［6］吴立宏，叶燕，李兴尚，等 反相高效液相色谱法测定道地产区秦艽药材中龙胆苦苷的含量［J］. 药物分析杂志，2009，29（2）：184~187

［7］李萍 高效液相色谱法测定风湿灵胶囊中龙胆苦苷含量［J］. 中国药业，2009，18（13）：25~26

(收稿日期：2012-04-28）