针刺对光老化大鼠皮肤组织中SOD、MDA、GSH-Px活性的影响
2012-04-29张小卿陶冶田国伟吴景东
张小卿 陶冶 田国伟 吴景东
[摘要]目的：研究针刺对于照射引起的皮肤光老化大鼠皮肤组织中超氧化物歧化酶(s0D)、丙二醛(MDA)的含量及谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)活性的影响，探讨针刺对抗皮肤光老化的作用。方法：将大鼠随机分成4组，除正常组外，其余各组模拟日光中uv(uVA+UVB)照射，造成皮肤光老化模型。每次造模前，针刺组给予电针刺激，阳性对照组采用VE涂抹造模部位，15周后对比各组生化指标结果。结果：模型组与正常组比较大鼠皮肤组织中SOD、GSH-Px活性明显降低，MDA含量明显增加(P<0.05)；针刺组与模型组比较SOD、GSH-Px活性增加，MDA含量明显降低(P
[关键词]针刺；光老化；超氧化物歧化酶；丙二醛；谷胱甘肽氧化酶
[中图分类号]Q591.3[文献标识码]A[文章编号]1 008-6455(2012)07-1168-03
皮肤光老化是源于紫外线(UV)损害，在光暴露部位的皮肤提早出现皱纹，并伴有皮肤干燥、粗糙、皮革样外观、毛细血管扩张、色素异常沉着、甚至癌变等。《黄帝内经》中说：“十二经脉，三百六十五络，其气血皆上于面而走空窍。”针灸对局部皮肤、穴位的刺激及对脏腑气血的调摄，在防止皮肤皱纹产生，延缓皮肤衰老方面有确切疗效。由于自由基损伤与衰老密切相关，故本实验以UV致大鼠皮肤光老化为研究对象，观察针刺对皮肤组织中自由基及各类酶活性变化的影响，旨在初步探讨针刺防治皮肤老化的作用机理，为临床应用提供科学依据。
1材料和方法
1.1实验动物与分组方法：健康雄性SD大鼠40只，体重(220±25)g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。随机分为4组，每组10只，分别为正常组、模型组、针刺组、VE组。各组每5只放入一笼饲养，常规饲食和饮水，无不良因素影响，在相同的自然环境下饲养1周，待其适应实验室环境后开始进行实验。
1.2主要试剂及设备：自制紫外线灯箱(40WUVB灯管4根，光谱集中在297nm；40WUVA灯管2根光谱集中在365nm)，uv辐照计(台湾路昌)，6805D电针仪，劲霸电推剪；SOD试剂盒、MDA试剂盒、GSH-Px试剂盒(南京建成生物有限公司)；维生素E胶丸(天海药业)：-70℃冰箱、匀浆器、离心机、恒温水浴箱、分光光度计均由辽宁中医药大学实验教学中心提供。
1.3实验方法：模型组大鼠不予任何治疗。针刺组大鼠在密封罐中用乙醚麻醉，昏迷后取出在大鼠固定架上捆绑，以28号0.5寸毫针针刺大鼠双侧“脾俞”、“肾俞”、“足三里”穴，直刺8mm，疏密波，刺激时间20min，以大鼠肢体或针柄微微颤动为度，每日一次，于针刺后30min开始造模。VE组大鼠于造模前30min，在背部剪毛区域内涂抹VE后造模。
1.4造模方法：参考杨汝斌SD大鼠皮肤光老化动物模型剂量及方法，每只大鼠均用电推剪剪除大鼠背部5.0cm×5.0cm区域内毛发，以后每次照射前用剃须刀剃除该部位的毛发。动物适应性喂养1周后，第2周开始将模型组、针刺组、VE组大鼠放入自制照射箱中，并置于距离光源30cm处的水平面上，第2周每天照射2h，第3～7周每天照射4h，第8～12周每天照射6h，照射以5天为一个周期，间隔2天，再开始下一个周期。至13周时终止UV暴露(UVA照射强度累计为148.47J／cm2，UVB辐照强度累计为48.67J／cm2)，继续观察1周。造模过程中每天观察动物背部皮肤有无水疱及糜烂等，如果出现上述症状，立即停止照射2～3天，至上述症状消失后再继续照射，直至造模成功。
1.5取材：15周将各组大鼠断颈处死，迅速取背部光老化处皮肤组织全层，保存于-70℃冰箱中待测。
1.6生化指标测量：紫外分光光度计分别测定各组大鼠皮肤组织中SOD、GSH-Px活性及MDA的含量。各项指标的测定均按照试剂盒说明书进行测定，采用化学比色法。
1.7统计学方法：本实验数据采用SPSS(16.0)软件，运用多个样本均数比较的方差分析检验，数据以x±s表示，并用最小显著差法(LSD法)作两两比较。
2结果与分析
2.1各组大鼠皮肤组织中SOD活性比较：从表l可见，模型组大鼠皮肤组织中SOD活性明显降低，与正常组比较有统计学意义(P<0.05)；而针刺组和VE组SOD活性分别与正常组和模型组比较均有差异(P<0.05)，提示针刺和局部外涂维生素E均能提升光老化大鼠皮肤组织中SOD活力，具有抗皮肤光老化作用，但是与正常大鼠比较还有差异。
2.2各组大鼠皮肤组织中MDA含量比较：模型组大鼠皮肤组织中MDA含量增加，与正常组比较有统计学意义(P<0.05)；针刺组、VE组MDA含量和模型组比较有差异(P<0.05)，而针刺组与正常组比较无差异(P>0.05)。提示针刺降低光老化大鼠皮肤组织MDA含量疗效显著。
2.3各组大鼠皮肤组织中GSH-Px活力比较：模型组大鼠皮肤组织中GSH-Px活力明显降低，与正常组比较有统计学意义(P<0.05)：而针刺组和VE组GSH-Px活力分别与正常组和模型组比较均有差异(P<0.05)，提示针刺和局部外涂维生素E在一定程度上可以提升光老化大鼠皮肤组织GSH-Px活力，二者疗效相似。
3讨论
皮肤光老化是指由于长期的日光照射导致皮肤衰老或加速衰老的现象。人们通常把由于遗传及不可抗拒的因素(如地心引力、机体重要器官的生理功能减退等)引起的皮肤内在性衰老称为自然老化，把由于环境因素如紫外辐射、吸烟、风吹及接触有害化学物质引起的皮肤衰老称为外源性老化。由于日光中紫外辐射是环境因素中导致皮肤老化的主要因素，所以通常所说的外源性皮肤老化即指皮肤光老化。
皮肤老化是机体衰老的外在反映，中医学认为，肾为先天之本，人的生、长、壮、衰、老过程中，主要决定于肾气的盛衰。肾气盛衰，可影响其他脏腑及所有组织器官，故治衰老性疾病，必以滋肾为主。脾胃为后天之本，为气血生化之源，以荣养五脏六腑、形体百骸，为滋养元气之本和生血之源，人之盛衰与脾胃的关系至关重要，故治疗衰老性疾病，亦须滋养脾胃。故本实验选用肾俞、脾俞和足三里防治大鼠皮肤光老化，旨在补。肾填精，健脾益胃。
机体的衰老源于细胞的衰老，自由基学说认为：自由基攻击细胞膜，使膜中多元不饱和脂肪酸过氧化，从而损害细胞的结构和功能，是造成衰老的主要机理。MDA是氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物，它能生成聚合物并与人体内的蛋白质和脱氧核糖核酸发生反应，使蛋白质的结构变异，导致变异蛋白质的细胞失去正常功能，甚至导致癌症。此外，MDA聚合物还能阻碍脱氧核糖核酸的复制而使人的老化过程加快，使人寿命缩短。因此对MDA的检测可反映出机体内脂质过氧化和机体细胞受自由基攻击的损伤程度。机体具有自由基的清除系统，包括低分子清除剂和酶性清除剂两种。GOD、GSH-Px是体内自由基清除系统中最重要的酶类。SOD是机体唯一能淬灭自由基的酶，可以把有害的超氧自由基转化为H2O2。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内活性极强的GSH-Px则能使H2O2迅速清除分解为完全无害的水，两者共同作用能有效地阻止组织细胞受过氧化的损伤。
我们在前期的研究观察了中药提取物(如绞股蓝、黄芪)对光老化小鼠和自然衰老小鼠皮肤组织中SOD、MDA、羟自由基(OH·)、羟脯氨酸(HYP)等指标的影响，结果均证实上述中药具有清除自由基和提升相关酶类活性的作用。本实验观察结果显示针刺组大鼠皮肤组织各种酶活性均有升高，MDA含量下降，与模型组均有明显的差异。因而证实针刺亦可提高人鼠体内老化相关酶的活性，增加抗自由基能力，从而对抗UV造成的皮肤光老化。
