酸浆宿萼总皂苷对小鼠胃癌细胞（MFC）生长的影响

任石涛，曹虎灵，王晓闻

（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷030801）

酸浆［Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino］又名红姑娘，为茄科植物酸浆带宿萼的果实［1］，是一种独特的浆果。酸浆的药理作用有：消炎、降血糖、降血脂、镇痛、抗氧化、抗菌和抗癌等［2］。

皂苷（Saponins）又称皂素，是广泛存在于植物界的一类特殊的甙类，它的水溶液振摇后可产生持久的肥皂样的泡沫，因而得名［3，4］。皂苷的药理作用有：双向调节免疫、抗缺氧、抗疲劳、，抗低温应激、抗脂质氧化和抗致突变作用等［5］。

近年来，大量的临床和实验研究证明，中药在肿瘤的防治和康复方面均具有重要的作用［6］。天然产物是新药研发的可靠和较好来源［7］。据不完全统计，来源于植物药的抗癌制剂，占总抗癌药物的32.25%。常用抗癌药物秋水仙碱、长春碱、紫杉醇等均来自天然产物的提取分离或合成［8］。近年来，一些皂苷也被发现具有防癌治癌的效果：人参皂苷Rh2，Rg3，Rs4等可通过抑制肿瘤细胞的生长和增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移等途径发挥抗肿瘤作用，且这些皂苷对正常细胞的毒副作用均较小［9～12］；杜德极［13］发现葛根总皂甙对P388白血病的3H－TdR掺入法均有不同程度的抑制作用；徐长福［14］发现绞股蓝总皂甙（GP）对S180肉瘤有明显抑制作用，使肿瘤生长延缓，瘤周期中淋巴细胞、巨噬细胞浸润明显增多。在对植物酸浆的研究中，分离出酸浆总皂苷，并对肿瘤细胞的生长等方面的影响进行探索性研究，以期扩展酸浆的应用。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

酸浆宿萼：采自山西省大同市阳高县种植基地

小鼠胃癌细胞（MFC）：购于北京北纳创联生物技术研究院

1.2 试验试剂

RPMI－1640培养基（美国Gibico公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）、胰蛋白酶，MTT（Sigma公司）、青，链霉素（华北制药）、DNA ladder maker（生工生物工程）、细胞凋亡检测试剂盒（TaKaRa公司）、二甲基亚砜（DMSO）（北京试剂公司产品）

1.3 试验仪器

凝胶成像系统（捷达）、酶标仪（Thermo Labsystems）、医用型超净工作台（上海博讯实业有限公司）、电泳仪／槽（北京市六一仪器厂）、倒置相差显微镜（OLYMPUS公司）、二氧化碳培养箱（HEAL FORCE）、可调式微量移液器（德国Eppendorf）、离心机（上海安婷科学仪器有限公司）

2 试验方法

2.1 肿瘤细胞体外培养

小鼠胃癌细胞MFC以适量浓度接种于培养瓶中，加入RMPI－1640培养液（含10%小牛血清），置于37℃，5%CO2，饱和湿度恒温培养箱中培养。隔天换液一次，细胞呈单层贴壁生长，每3～4天传代一次，传代时加1mL胰蛋白酶消化5～10s，用培养液吹打制成细胞悬液，按照所需要的浓度接种。

2.2 不同浓度TPS对小鼠胃癌细胞MFC细胞形态的影响

根据文献中细胞培养方法［16～18，20］。用胰蛋白酶消化 MFC细胞，用含10%FBS RMPI－1640培养液制成细胞悬液，以适当的细胞密度将细胞悬液加入96孔板中，置于二氧化碳培养箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24h，然后加入不同浓度的TPS，使 TPS的终浓度分别为0、0.5、10、20、40、80μmol·L－1，继续培养24h后在显微镜下观察、记录。

2.3 不同浓度TPS对小鼠胃癌细胞MFC细胞增殖抑制的影响

根据文献中细胞增殖抑制培养方法［16～20］。取对数生长期 MFC细胞，用含10%FBS RMPI－1640培养液制成一定浓度细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔体积100μL。将培养板移入CO2培养箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24h，吸掉培养基然后加入含有不同浓度TPS（0、0.5、10、20、40、80μmol·L－1）的培养基100 μL，继续培养24h，每孔加入 MTT溶液（5g·L－1）50μL后，继续培养4h，小心吸弃孔内培养上清液，加入150μL DMSO轻轻振荡使之充分溶解，选择460nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，进行细胞增殖分析。同样的方法分别在48，72h进行培养。用酶联免疫检测仪在460 nm波长下测定各孔光吸收值（A），进行细胞增殖分析。

2.4 不同浓度TPS对小鼠胃癌细胞MFC细胞凋亡的影响

根据细胞凋亡检测试剂盒步骤。把106～107的细胞用PBS（－）Buffer清洗后，悬浮于少量的PBS（－）Buffer中，移入1.5mL Micro tube中，离心5min，除去上清。将Micro tube底部的细胞沉淀加入100μL的Lysis Buffer，用振荡器激烈混合10s后，离心5min。把上清移入1.5mL Micro tube中。其沉淀再加入Lysis Buffer重复一次。合并上清液，向其中加入10%SDS Solution 20 μL，再加入Enzyme A 20μL，56℃反应1h。反应完成后加入Enzyme B 20μL，37℃反应1h。加入Precipitant 130μL、0.95mL的乙醇，－20℃放置1h以上。取出离心15min，弃上清，用80%乙醇清洗沉淀。同样离心15min后除去乙醇，干燥沉淀。向沉淀中加入适量的TE Buffer（10～50 μL左右）充分搅拌溶解，得到凋亡细胞的片断化μDNA。得到的DNA样品的一部分，按样品：6×Loading buffer＝5∶1的比例混合后（全量6～15 μL），进行琼脂糖凝胶电泳。

3 结果与分析

3.1 不同浓度TPS对MFC细胞形态的影响

由图1可以看出，a图为正常生长细胞，呈现拉网状的生长。b、c、d、e、f为加入TPS后 MFC细胞的情况，细胞数不同程度的减少，细胞形态发生改变，表现为胞浆皱缩，染色质浓聚，形成致密的染色质，特别是图e和图f的细胞，细胞体积缩小、成圆状，凋亡小体形成、细胞发生凋亡。随着浓度的增大细胞形态改变的越明显。

图1 24h不同TPS浓度下小鼠胃癌细胞的形态Fig.1 Cell morphology changes of MFC treated by different TPS concentration注：a、b、c、d、e、f TPS浓度分别为0、5、10、20、40、80μmol·L－1Note：a，b，c，d，e，f present the concentration of TPS 0，5，10，20，40，80μmol·L－1 respectively.

3.2 不同浓度TPS对小鼠胃癌细胞MFC的增殖抑制

不同浓度TPS作用于MFC，24、48、72h后用MTT法测定细胞生长，结果见表1、图2。

由表1可以看出，40μmol·L－1和80μmol·L－1在不同的时间段与对照组比较均差异极显著（p＜0.01）；10μmol·L－1和20μmol·L－1在不同的时间段与对照组相比均差异显著（p＜0.05）；5 μmol·L－1与对照组相比在各个时间段均差异不显著（p＞0.05）。从24h开始，不同浓度TPS即对MFC细胞的增殖表现出不同程度的抑制作用，到72h最大抑制率达到53.06%。TPS对 MFC的抑制作用呈浓度依赖关系。当TPS浓度分别为20、40、80μmol·L－1抑制率分别为25.85%～34.96%，35.37%～41.67%，42.00%～53.06%。说明TPS对癌细胞有一定的抑制作用，抑制的效率随着TPS的浓度增加而增强。

3.3 不同浓度TPS对小鼠胃癌细胞MFC细胞凋亡DNA片段分析

TPS感染MFC细胞电泳图谱见图3。

表1 不同浓度TPS对MFC细胞增殖抑制影响（X±SD）Table 1 The inhibitory rates of TPS of different concentrations on MFC（X±S）

图2 不同浓TPS对MFC细胞增殖抑制率Fig.2 The inhibitory rates of TPS of different concentrations on MFC

图3 TPS感染MFC细胞24h、48h、72h3个时间段的电泳图谱Fig.3 The electrophoretic results of TPS infect MFC cells in 24h，48hand 72hrespectively注：M 为 Marker（100bp）；0（对照组）、5、10、20、40、80μmol·L－1分别为不同浓度的TPSNote：M is Marker（100bp）；0，5，10，20，40，80μmol·L－1 mean the TPS concentration

由图3可以看出，24h、48h、72h3个时间段的对照组细胞无凋亡，不呈现DNA条带；TPS加入24h后的电泳DNA片段不明显，只在最大浓度80μmol·L－1处出现DNA片段；TPS加入48h、72h后的细胞DNA均出现细胞凋亡的典型梯状条带，且72h最明显。该电泳结果可初步说明MFC细胞凋亡受TPS的作用剂量和作用时间影响。作用的时间越长干预效果越强；在相同的时间段里呈剂量依赖性。说明TPS对癌细胞有一定的致死效用，作用的时间的越长，效果越明显，且呈现剂量依赖性。

4 结论与讨论

细胞凋亡（apoptosis），即程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD），是指细胞在分化和发育过程中由基因调控而发生的主动的、自发性死亡方式，它与坏死有着本质的区别［16，20～23］。尽管凋亡是一种生理性细胞死亡，但它也能被各种病理因素所触发，任何可直接破坏细胞、导致细胞坏死的物质，均可诱发细胞的凋亡［17，20］。

通过对细胞形态的观察发现，加入不同浓度的TPS作用24h后细胞数量明显少于对照组，凋亡发生率升高，细胞失去贴壁的能力，细胞由不规则形逐渐变成圆形，胞浆皱缩，细胞体积缩小，凋亡小体生成，且浓度越高作用效果越明显。实验结果显示，当TPS浓度分别为20、40、80μmol·L－1抑制率分别为25.85%～34.96%，35.37%～41.67%，42.00%～53.06%。所以TPS能够抑制 MFC细胞增殖，且呈时间浓度依赖性；TPS能引起肿瘤细胞的凋亡，并且随着浓度的增加其凋亡作用就越明显。在48h和72h10、20、40、80μmol·L－1的TPS与对照组相比能显著提高细胞凋亡效果。通过本实验的研究结果还能看出，随着作用时间的延长其凋亡效果也随之上升，表现出一定的浓度依赖性。在以后的试验中，对其最大作用剂量和毒性进行研究，可能将其作为新的抗肿瘤药物得以开发和利用。

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