应激大鼠髁突软骨细胞中TNF-α mRNA的表达水平变化

王晓菲

颞 颌 关 节 病 （temporomandibular disorders，TMD）是人群中的一种常见病和多发病。对其发病机制迄今尚无统一认识。近年来，有关颞颌关节病的机理和治疗一直困扰着国内外学者，尤其是精神应激方面，国内外鲜有报道。为了进一步探讨精神影响与TMD的关系，笔者通过动物模型，应用组织形态学方法，观察心理刺激不同时期对相关炎性因子TNF-α的表达，以探讨精神心理因素在颞下颌关节病发病机制中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠，一级，75只，体重（150±10）g，雄性，由山东大学动物中心提供。

1.2 仪器与设备 随机应激仪，自制，装置分为两部分即刺激仪和刺激笼。刺激仪在结构上由随机发生器和输出电路组成。随机发生器由2个震荡器形成随机组合的脉冲，经延时后控制连续波发生器，后者产生4 Hz的连续频率，它的持续时间即刺激时间可在2、5、10 s内选择，随机形成的连续波经输出电路输出，输出脉冲的空载幅度为150 V。

1.3 实验动物分组和方法 将75只大鼠分为空白对照组、电击组（foot-shocked，FS）、应激组（emotional stress，ES）、药物对照组（anti-anxiety-drug，AAD）、生理盐水组（saline injection，SI），15只/组。 以上各组又随机分为10、20、30 d三个亚组，5只/组。

1.4 建立模型 模型建立时参考文献[1，2]的建模方法。电击组：每天固定时间给予足部电击30min，1次/d，电压80 V，应激频率4 Hz，以维持受刺激动物惊恐、紧张和愤怒的应激状态。应激组：电击组受电击后排便，竖毛，尖叫等反应影响该组大鼠。药物对照组：实验前30 min给抗焦虑抑郁注射液1 mg/kg体重，与心理对照组同时进行。生理盐水组：实验前30 min给予同药物组剂量的盐水注射。空白对照组：不给予以上应激影响。

各组大鼠的体重、性别通过均衡检验，证实无统计学差异。各组大鼠均为普通固体饲料，自由饮水，同等饲养。实验开始前1周，将大鼠放入交流箱中适应1周，不给予应激。应激时间设置为10 d组、20 d组和30 d组。其中电击组大鼠仅作为应激源，不参与实验测试。药物对照组、生理盐水组与应激组大鼠一样，同期、同样的条件下开始实验，但这两组大鼠在实验前30 min分别皮下注射抗焦虑抑郁药和生理盐水。每天上午的固定时间给予应激，以严格对照，保证研究结论的可靠性。

1.5 软骨细胞的分离 直视下切取髁突软骨层，放入盛有无钙平衡盐液（D-Hanks液）的平皿中，眼科剪尽量剪碎，移入离心管内10倍量胰蛋白酶37℃振荡，消化30 min，0.2%胶原酶Ⅱ37℃振荡下消化2 h，10 ml混合培养基（含20%胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml，抗坏血酸50 U/ml）培养于37℃ 5%CO2培养箱内，48 h后首次换液，以后隔天换液。透明软骨细胞长成单层后，进行传代，弃去培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2遍，0.5%胰蛋白酶约10 ml消化5 min，DMEM混合培养基反复吹打成单细胞悬液，消化传代至平底24孔培养板，每孔种植细胞数约5×10 G个。

1.6 大鼠髁突软骨细胞培养物上清TNF-α含量测定 严格按Promage公司试剂盒使用说明书操作，以ELISA法定量测定。

1.7 总RNA提取 PBS0.01%mol/L，冲洗离心后加Catrimox-14AM 等量简单地粉碎细胞，Gene Quaant-proRNA/DNA定量RNA最后溶于RNA缓冲液中，吸取5 μlRNA样品在20 μl反应体系中进行反转录反应。反应条件为37℃水浴5 min，37℃水浴60 min及70 min加热10 min；PCR反应体系为50 μl，扩增条件为:变性94℃ 30 s，复性50℃40 s延伸72℃ 40 s，35个循环，凝胶成像分析系统观察摄片。

1.8 髁突软骨细胞分离纯化 按常规方法以髁突软骨细胞分离液分离静脉血髁突软骨细胞PBMC[3]，采用异硫氰酸胍一步法，严格按Promage公司试剂盒使用说明书操作。

1.9 cDNA合成 0.5%焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理过的微量离心管中。

1.10 RT-PCR参数 TNF-α循环参数：94℃预变性3 min；变性94℃ 1 min，退火58℃ 115 min，延伸72℃ 2 min，30个循环；最后延伸2 min。

引物设计如下：TNF-α 上游 （5’-3’）：AGG CGC TCC CCA AAA AGA TG；下游（5’-3’）：TGG CGG AGA GGA GGC TGA CT。 β-actin上游（5’-3’）：CTA TCG GCA ATG AGC GGT TC；下游（5’-3’）：CTT AGG AGT TGG GGG TGG CT。

2 结 果

2.1 PCR结果 TNF-αmRNA在应激后第10天表达最强，以后逐渐达到正常水平（图1）；实验第10天应激组和生理盐水组的各种细胞因子mRNA升高最显著，药物对照组较以上两组有所下降并接近对照组。药物对照组和生理盐水组变化不大，但与对照组相比明显增高（图2）。

图1 生理盐水注射组不同时期各种细胞因子mRNA水平变化情况

图2 实验第10天应激组和生理盐水组的各种细胞因子mRNA变化

2.2 EISA检测结果 药物对照组恢复至第10天血清中TNF-alpha的OD值经t检验与对照组无统计学差异，故可认为药物对照组恢复至第10天可达到正常水平（图3）。

图3 药物对照组恢复至第10天血清中TNF-α水平

3 讨 论

近年来研究发现，社会心理因素与TMD的发生、发展及治疗效果有着密切关系。甚至有学者认为TMD是一种心身疾病。List等[3]在研究成人TMD患者时发现，一些心理因素如高水平应激、躯体不适、情绪障碍等扮演着更为重要的作用。Kafas等[4]通过问卷调查、以及曲面断层X线检查等手段进行评价分析，结果显示TMD与患者的心理状态关系密切。基于社会心理因素与TMD的关系，许多学者在治疗方面作了一些有益的探索。Turner等[5]应用行为认知法治疗TMD，结果表明在缓解疼痛及TMJ运动受限方面效果显著，在随后的长期随访中证明该方法疗效可靠。此外，催眠疗法、生物反馈疗法等地运用也显示了较好的效果[6]。

目前，TMD的确切病因和发病机理尚不明了，有研究发现颞下颌关节紊乱症患者的关节局部组织产生大量细胞因子TNF-α等，然而这些细胞因子对关节软骨细胞增殖、代谢和凋亡的作用机理和影响途径迄今尚无定论[7]。TNF-α由单核吞噬细胞和其它类型细胞产生并作用于这些细胞来调节粘附分子、免疫球蛋Fc受体、一氧化氮合成和金属蛋白酶产生及其它细胞因子分泌，同时促进结缔组织和内皮细胞激活。其主要功能是致炎作用，并能直接或间接地介导骨组织吸收。已经有证据表明TNF-α在软骨细胞的降解-退变过程中起到最重要的分解作用。本文结果说明1周时，应激组，生理盐水组大鼠的TMJ髁突软骨有严重的炎性反应，而随着时间增加，炎性反应会渐渐减轻，这可能因为应激采取了单一的应激模式，大鼠渐渐适应了这种应激方式的原因。而应激前给适当的地西泮类药物可以减轻应激对TMJ的影响。

细胞因子是低分子量蛋白质，是炎症和免疫过程起始因子和效应器，其中TNF-β起重要作用。T细胞经抗原刺激后表达IL-1受体，在IL-1作用下被活化，从而分泌IL-2、IFN、GM-CSF、IL-4等细胞因子，增加T细胞表面MHC2类抗原的表达，诱导细胞毒性T淋巴细胞的分化，诱导单核/巨噬细胞产生TNF，并通过单核细胞和巨噬细胞产生IL-8介导对中性粒细胞的趋化作用，加速血纤维蛋白原、C反应蛋白等的合成[8]。TNF-活化单核／巨噬细胞，提高其杀伤活性，释放超氧、促进NO、IL-2等细胞因子的产生，促进中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞粘附到内皮细胞上，从而参与炎症反应[9]。笔者在实验中发现应激后各组大鼠软骨细胞TNF-α有变化，表明应激过程中TNF-α参与了炎症和免疫过程，当应激超过一定强度时，就会发生炎症反应。

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[3]List T，Wahlund K，Larsson B.Psychosocial functioning and dental factors in adolescents with temporomandibular disorders:a casecontrol study[J].J Orofac Pain，2001，15(3):218-227.

[4]Kafas P，Leeson R.Assessment of pain in temporomandibular disorders:the bio-psychosocial complexity[J].Int J Oral Maxillofac Surg，2006，35(2):145-149.

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