纳米支架在组织工程中的研究进展

钟小忠， 李佳楠

（江汉大学 生命科学学院， 湖北 武汉 430056）

骨缺损是临床上的常见病， 也是骨科治疗的难题之一。 骨组织因其自身组织结构的生长特性， 一旦发生大面积缺损、 骨不连、 骨组织萎缩、骨折、 愈合不良等病变后， 难以再生修复， 给患者带来极大痛苦。 自体骨移植目前是治疗骨缺损的黄金标准， 然而自体骨移植需要通过额外的手术来获得移植骨， 往往给患者带来巨大的痛苦，手术感染率也极高， 并且来源有限。 作为另一种选择， 异体骨移植虽然来源丰富， 但存在着免疫排斥、 晚期感染、 移植骨愈合缓慢以及可能导致交叉感染等问题［1］。 组织工程学则为研究人员解决这些问题提供了新的思路。 组织工程学是研究开发能够用于修复、 维持或改善损伤组织功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。

组织工程学的研究主要有3 个要素［2］： 细胞是一切生物组织最基本的结构单位； 支架是用于支撑细胞成长为一个完整的组织的框架材料； 生长因子用于影响细胞活动。 在骨组织工程中， 研究的主要方向在于如何构建三维支架， 提供一个微环境 （人工合成的临时细胞外基质ECM）， 以供细胞吸附、 增殖、 分化， 然后形成新的组织。因此， 支架材料的选择对于新生组织的形成非常重要。 良好的支架材料必须具有生物可降解性， 且降解的速率要同新组织的形成同步， 以便留出足够的空间供新生组织生长。 同时支架材料及其降解产物都必须具有良好的生物相容性。 纳米材料以其超微的结构、 良好的生物相容性及较广泛的生物学活性等优势， 近年来逐渐成为组织工程研究的优先选择材料。

纳米结构通常指尺寸在1 ～100 nm 范围的微小结构， 比微米结构小上千倍。 当纳米粒子的表面原子数与总原子数之比随粒径变小而急剧增大后， 会引起性质上的变化。 由于纳米粒子表面原子数增多， 表面原子配位数不足及高的表面能，使这些原子易与其他原子相结合而稳定下来， 故具有很高的化学活性。 而且纳米纤维具有与天然ECM 相近的微观结构， 使制备的支架能够模仿天然ECM 的结构特点； 极高的比表面积也为活性因子的有效释放提供了理想平台。 因而纳米纤维有望被制成理想的组织工程支架。

1 纳米纤维支架材料的特性

支架作为一个临时ECM， 给细胞提供了再生的环境， 因此必须模拟天然ECM 的有利特性。与天然ECM 不同的是， 组织工程设计的支架不但要提供组织生长的空间， 还需具备加速组织再生的能力。 因此人工设计的支架主要是将能加速组织再生的特性（如孔隙率、 孔径、 孔间连接等）进行最优化的组合。 笔者讨论支架材料的两个主要特性， 即生物可降解性以及结构特性。

1.1 生物可降解性

医学领域中， 生物可降解性被理解为在机体生理条件下， 通过水解、 酶解， 从大分子物质降解为对机体无害的小分子物质， 或者小分子物质在机体内自行降解， 最后通过机体的新陈代谢完全吸收和排泄， 对机体不产生毒副作用［3］。 在组织工程中， 支架材料的生物可降解性是必须的，并且其降解的速率应与组织再生的速率同步， 从而实现支架的模板功能。 一些合成的线性脂肪族聚酯拥有良好的生物相容性及生物可降解性， 如聚乳酸（PLA）、 聚羟基乙酸（PGA）、 乳酸－羟基乙酸共聚物（PLGA）等。 它们常常被用作构建支架的聚合物［4－6］。 聚乙烯（PEG）不具备生物可降解性， 但是作为一种优秀的生物相容性水凝胶材料， 其机械特性类似于一些软组织， 如软骨［7］。Han 等［8］将PEG 与PLA、 PGA 或PLGA 混合成为共聚物， 弥补了其不可降解之不足。

另一种获得生物可降解性材料的方法是在聚乙烯的基础上， 合成一种可供金属蛋白酶（MMPs）降解的共聚物［9］。 这种方法是模仿天然ECM 中的胶原蛋白以及其他成分可以被酶降解的特性。 这些共聚物能够聚合形成交联的水凝胶网络结构， 进一步又可以被细胞分泌的MMPs降解。

1.2 结构特性

当生物支架被植入机体后， 要能提供一定的机械强度和结构来支持新组织的形成。 因此， 生物支架除了具备高效的生物活性以外， 还必须拥有一些关键的形态特征。 多孔性是支架构建过程中的一个重要因素， 多孔结构有利于促进细胞的分布并且引导组织的生长。 具有多孔结构的材料， 孔隙率越高， 越有利于细胞在材料表面爬行、 附着、 生长和繁殖， 同时也利于营养物质的运输。 Oh 等［10］将PLGA 和聚己酸内酯（PCL）混合构建了一个多孔结构支架， 该支架不仅可以提高蛋白装载能力， 还能得到可控的降解速率。 多孔结构材料孔径的大小也非常重要， 它要能提供一个最优化的表面积， 以供细胞吸附。 当孔径太小时， 就会抑制细胞的迁移， 导致细胞坏死［11］。 而当孔径过大时， 将不能提供足够的表面积让细胞吸附［12］。 因此在设计多孔支架时， 要从多方面的参数考虑， 如孔形态、 孔间连接以及整体的通透性等。

2 纳米纤维支架构建技术

天然ECM 中， 很多蛋白都是纤维结构， 具有纳米级的直径。比如胶原， 作为人体ECM 中含量最丰富的蛋白， 是由直径50～500 nm 的纤维束构成的纤维结构。 虽然现在开发出了大量的技术用来构建支架， 但是将纤维结构控制在纳米级的技术主要有3 种： 电纺丝技术、 自组装技术以及热致相分离技术。

2.1 电纺丝技术

电纺丝技术的产生已经有100 多年［13］， 在应用于组织工程构建纳米纤维支架以前主要是用来生产工业产品［14］。 电纺丝是一种将聚合物溶液在强电场作用下形成喷射流， 然后在搜集器上产生纳米级或微米级的纤维的技术［15］。 由于使用简单， 并且能使用多种材料产生纳米纤维， 因此这方面的研究一直是一个热点。 一些天然大分子（如胶原蛋白、丝心蛋白以及纤维蛋白原等）和人工合成的聚合物（如PGA、PLLA、PLGA、PCL 等）已经通过这种技术来构建纳米纤维支架。 纤维的直径可以通过改变溶液的浓度来调整， 浓度越高的溶液产生的纤维直径越大。 然而， 电纺丝技术产生的是二维的片状结构， 三维体系则是将二维的片状结构层叠起来， 因此很难产生良好的多孔性和复杂的几何结构［16］。 目前Moroni 等［17］尝试着将电纺丝与3D 印刷技术结合起来， 并成功构建了3D 沉降的粗纤维和电纺丝提供的微纤维交错的支架， 但是在这方面的研究还有待深入。

2.2 自组装技术

分子自组装是普遍存在于自然界的一种现象， 可以描述为自发的、 非外力引导的、 将单个实体有机地组织成具有有序结构的有机整体［18］。对分子自组装的定义是：在热力学平衡的条件下，由于一系列非共价键力 （包括氢键、 离子键、 范德华力和疏水作用力） 的作用， 分子自发地有机装配成一定结构的稳定集合［18］。 一些生物分子，比如多肽和蛋白质， 可以自组装成稳定的、 结构清楚的层次结构。 比如胶原分子就能自组装成原胶原分子， 并能进一步由3 个原胶原分子组装成直径50～500 nm 的胶原纤维。一些寡肽通过离子自组装可以形成由10～20 nm 直径的纤维相互交联而组成的水凝胶［19］。 分子自组装形成纳米纤维是一种由下而上的策略， 因此获得的材料往往比通过电纺丝得到材料要小［20］。 然而作为一种新兴技术， 分子自组装仍然有很大的局限性， 目前最大的问题是无法控制孔隙率和孔径的大小； 其次便是通过分子自组装构建的支架在机械强度上还有一定欠缺。

2.3 热致相分离技术

热致相分离技术（TIPS）的原理是当一个均相的多成分系统在特定条件下处于热力学不稳定时， 为了降低体系的自由能， 会倾向于分离而形成一个多相体系［21］。 TIPS 近年来已开始应用于组织工程多孔支架的构建。 在这个过程中， 当相分离时， 聚合物溶液会分离成两个相， 富聚合物相（高浓度聚合物）以及贫聚合物相（低浓度聚合物）。然后通过萃取、 蒸发或升华等方法除去溶剂， 富聚合物相就会固化并可形成一种开孔泡沫材料。使用不同的溶剂和聚合物、 调整聚合物的浓度或者相分离的温度， 可以得到不同孔形态的支架。这种方法形成的纤维直径范围在50～500 nm，并且孔隙率高达98%， 相对于其他方法产生的支架来说， 拥有更高的比表面积。

将TIPS 与一些加工技术（如颗粒沥滤技术或3D 印刷技术）结合， 可构建具有复杂三维结构以及良好孔形态的支架［22］。 Zhang 等［23］将PLLATHF 聚合物的溶液滴在一个模具中的糖颗粒上，然后冷却至预定的凝胶温度， 在相分离以后， 将凝胶-糖复合物用蒸馏水浸过， 以除去溶剂和糖颗粒， 再将样品冷冻干燥后， 最终制备了一个具有大孔的3D 支架。

3 纳米支架的表面修饰

天然ECM 的表面可直接影响细胞应答， 并最终影响新组织的形成速率和质量［24］， 因此生物支架与细胞之间的相互作用就显得非常重要。 当前的材料所构建的支架表面普遍缺乏生物识别能力， 因此必须通过修饰支架的表面以获得相应的特性来促进细胞和支架之间的相互作用。

目前已经有多种方法可用来修饰支架表面，但其中大部分方法都只能用来修饰二维的表面或者很薄的三维结构， 真正的三维支架的修饰仍十分困难。 Ma 等发明了一种静电分层自组装技术，可以用明胶来修饰PLLA 纳米纤维支架［25］， 这种技术的优点在于只要支架的孔互联， 就可以用来修饰任何复杂的3D 支架。 细胞在被修饰后的PLLA 支架上分化能力有了明显提高， 细胞分布率和密度也有了很大提升［25］。

4 纳米支架的生物效应

细胞的吸附、 增殖和分化对于新组织的形成是至关重要的， 而纳米纤维支架可增强细胞的上述活动， 构建有机的组织来替代受损组织。 纳米支架生物效应方面的研究目前刚刚起步， 资料十分有限。 因而笔者主要讨论细胞在支架上最主要的几种效应。

4.1 吸附和增殖

新组织形成的第一步是细胞吸附， 然后增殖、 迁移和分化。天然ECM 是由Ⅰ型胶原蛋白和其他蛋白质以及生物分子组成， 可为细胞提供一个基础的吸附结构［26］，供细胞吸附、迁移、增殖以及分化。 因此， 人工合成的ECM 倾向于模仿天然ECM 的这种结构和功能。

一些整联蛋白 （纤连蛋白、 玻连蛋白和层黏连蛋白）可以选择性地被吸附在纳米纤维支架上［27］。 这些蛋白可能与Ⅰ型胶原蛋白的结合有关， 它能让细胞与纳米纤维支架直接相互作用。成骨细胞、 成纤维细胞、 大鼠肾细胞、 平滑肌细胞、 神经干细胞和胚胎干细胞等多种细胞在纳米纤维支架上都表现出极高的吸附能力［28－32］。 还有研究表明具有分支的纳米纤维比线性的纳米纤维具有更高的可吸附能力［33］。 这些增强的吸附能力使得纳米纤维支架能更快地促进组织再生。

当细胞吸附在支架上以后就要进行迁移以及增殖， 直到充满整个支架后开始形成组织。 一些细胞在纳米纤维支架上显示出更高的增殖能力。Chen 等［34］将成骨细胞在纳米纤维支架上培养7 d以后， 发现细胞数目是在传统支架上的3 倍。

4.2 分化

从细胞分化成具有高度特异性的组织是一个由多种因素影响的复杂过程。 目前包括成骨细胞、 软骨细胞在内的多种细胞都在纳米纤维支架上表现出了更强的分化能力［35］。 当未成熟的细胞开始向成骨细胞分化时， 会表达出一系列特定的蛋白， 当开始分泌骨钙素和骨涎蛋白时， 表达量会达到顶点。 Li 等［36］发现这些蛋白有利于细胞分化为成骨细胞， 并且其表达量在纳米纤维支架上会有明显增加。 当蛋白表达到一定程度时， ECM开始矿物化， 而在纳米纤维支架上， 矿物的分布会更加均匀［34］。

在纳米纤维支架上可以培养出分布更均匀的细胞， 以及更接近于组织的类组织单元。 Shin等［37］将体外和体内培养结合起来， 产生了血管化、 矿物化以及嵌入的类骨细胞的骨组织。 所有这些研究都表明纳米纤维支架拥有培养功能性、可替代骨组织的潜能。 因此， 目前的研究还需要在培养条件和支架设计上更加深入。

5 结语

组织工程作为一门蓬勃发展的新兴学科， 对于再生医学的发展起着巨大的推动作用， 而纳米纤维支架在其中扮演了十分重要的角色。 通过模仿天然ECM 的结构和特性制备的支架材料可提高细胞和支架之间的相互作用， 增强细胞的吸附、 增殖和分化， 加快组织再生。 然而作为一种新的概念， 这方面的研究依然有待深入。 随着各种新技术和新材料的进一步发展， 必定能设计出更加完善的支架， 以达到产生完美替代组织的目标。

［1］ 刘斌.同种异体骨的易感疾病风险与控制［J］.中国矫形外科杂志，2009，17（15）：1164-1166.

［2］ Ma P X. Scaffolds for tissue fabrication［J］.Materials Today，2004，7：30-40.

［3］ 顾伟，刘雷良，左保齐.天然生物可降解材料在生物医学领域中的运用［J］.苏州大学学报：工科版，2006，26（1）：117－119.

［4］ Zhang R，Ma P X. Poly（alpha－hydroxyl acids）／hydroxyl apatite porous composites for bone tissue engineering：I Preparation and morphology ［J］. J Biomed Mater Res，1999，44：446-455.

［5］ Zhang R， Ma P X. Degradation behavior of porous poly（a－hydroxyl acids）／hydroxyl apatite composite scaffolds［J］. Polym Prepr，2000，41：1618-1619.

［6］ Zhang R， Ma P X. The effect of surface area on the degradation rate of nano－fibrous poly （L－lactic acid）foams［J］. Biomaterials，2006，27：3708-3715.

［7］ Bryant S J，Bender R J，Durand K L，et al. Encapsulating chondrocytes in degrading PEG hydrogels with high modulus： engineering gel structural changes to facilitate cartilaginous tissue production［J］. Biotechnol Bioeng，2004，86：747-755.

［8］ Han D K， Hubbell J A. Synthesis of polymer network scaffolds from L－lactide and poly（ethylene glycol） and their interaction with cells ［J］. Macromolecules，1997，30：6077-6083.

［9］ West J L， Hubbell J A. Polymeric biomaterials with degradation sites for proteases involved in cell migration［J］. Macromolecules，1999，32：241-244.

［10］ Oh S H，Park S C，Kim H K，et al. Degradation behavior of 3D porous polydioxanone－b－polycaprolactone scaffolds fabricated using the melt－molding particulate－leaching method［J］. J Biomater Sci Polym Ed，2011，22：225－237.

［11］ Rose F R，Cyster L A，Grant D M，et al. In vitro assessment of cell penetration into porous hydroxyapatite scaffolds with a central aligned channel［J］. Biomaterials，2004，25：5507-5514.

［12］ O′Brien F J，Harley B A，Yannas I V，et al. The effect of pore size on cell adhesion in collagen－GAG scaffolds［J］. Biomaterials，2005，26：433-441.

［13］ Morton W J. Method of dispersing fluids［J］.US patent，1902，7（5）：691.

［14］ Li W J， Laurencin C T， Caterson E J， et al. Electrospun nanofibrous structure：a novel scaffold for tissue engineering［J］. Journal of Biomedical Materials Research，2002，60：613-621.

［15］ Reneker D H， Chun I. Nanometre diameter fibres of polymer， produced by electrospinning［J］. Nanotechnology，1996，7：216-223.

［16］ Srouji S， Kizhner T， Suss－Tobi E， et al. 3－D nanofibrous electrospun multilayered construct is an alternative ECM mimicking scaffold［J］. J Mater Sci： Mater Med，2008，19：1249-1255.

［17］ Moroni L， Schotel R， Hamaan D， et al. 3D fiber－deposited electrospun integrated scaffolds enhance cartilage tissue formation［J］. Adv Funct Mater，2008，18：53-60.

［18］ Zhang S.Emerging biological materials through molecular self－assembly［J］. Biotechnol Adv，2002，20：321-339.

［19］ Beniash E，Hartgerink J D，Storrie H，et al. Selfassembling peptide amphiphile nanofiber matrices for cell entrapment［J］. Acta Biomater，2005，1（4）：387-397.

［20］ Hartgerink J D， Beniash E， Stupp S I. Self-assembly and mineralization of peptide-amphiphile nanofibers［J］. Science，2001，294：1684-1688.

［21］ Ma P X. Biomimetic materials for tissue engineering［J］. Advanced Drug Delivery Reviews，2008，60：184-198.

［22］ Wei G B， Ma P X. Macroporous and nanofibrous polymer scaffolds and polymer／bone－like apatite composite scaffolds generated by sugar spheres ［J］. Journal of Biomedical Materials Research：Part A，2006，78A（2）：306-315.

［23］ Zhang R Y，Ma P X. Synthetic nano－fibrillar extracellular matrices with predesigned macroporous architectures ［J］. Journal of Biomedical Materials Research，2000，52：430-438.

［24］ Shin H，Jo S，Mikos A G. Biomimetic materials for tissue engineering［J］. Biomaterials，2003，24（24）：4353-4364.

［25］ Liu X H，Smith L A，Wei G B，et al. Surface engineering of nano－fibrous poly （L－lactic acid） scaffolds via self－assembly technique for bone tissue engineering［J］.Journal of Biomedical Nanotechnology，2005，1（1）：54-60.

［26］ Kadler K. Matrix loading： assembly of extracellular matrix collagen fibrils during embryogenesis［J］. Birth Defects Res C Embryo Today，2004，72：1-11.

［27］ Woo K M， Chen V J， Ma P X. Nano－fibrous scaffolding architecture selectively enhances protein adsorption contributing to cell attachment［J］. J Biomed Mater Res A，2003，67（2）：531-537.

［28］ Woo K M，Jun J H，Chen V J，et al. Nanofibrous scaffolding promotes osteoblast differentiation and biomeneralization［J］. Biomaterials，2007，28：335-343.

［29］ Schindler M， Ahmed I， Kamal J， et al. A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo－like organization and morphogenesis for cells in culture ［J］. Biomaterials，2005，26：5624-5631.

［30］ Xu C Y， Inai R， Kotaki M， et al. Aligned biodegradable nanofibrous structure： a potential scaffold for blood vessel engineering ［J］. Biomaterials，2004，25：877-886.

［31］ Yang F， Xu C Y， Kotaki M， et al. Characterization of Neural stem cells on electrospun poly （L－lactic acid）nanofibrous scaffolds［J］. J Biomater Scit Polymer Edn，2004，15（12）：1483-1497.

［32］ Nur－E－Kamal A， Ahmed I， Kamal J， et al. Threedemensional nanofibrillar surfaces promote self－renewal in mouse embryonic stem cells ［J］. Stem Cells，2006，24：426-433.

［33］ Storrie H，Guler M O，Abu－Amara S N，et al.Supramolecular crafting of cell adhesion ［J］. Biomaterials，2007，28：4608-4618.

［34］ Chen V J， Smith L A， Ma P X. Bone regeneration on computer－designed nano－fibrous scaffolds ［J］. Biomaterials，2006，27：3973-3979.

［35］ Woo K M， Jun J H， Chen V J， et al. Nano－fibrous scaffolding promotes osteoblast differentiation and biomineralization［J］. Biomaterials，2007，28：335-343.

［36］ Li W， Tuli R， Huang X， et al. Multilineage differentiation of human mesnchymal stem cells in a three－dimensional nanofibrous scaffold ［J］. Biomaterials，2005，26：5158-5166.

［37］ Shin M， Yoshimoto H， Vacanti J P. In vivo bone tissue engineering using mesenchymal stem cellson a novel electrospun nanofibrous scaffold［J］. Tissue Engineering，2004，10（12）：33-41.