影响暗发酵制氢因素的研究进展*

钱卫东，王婷

1(陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安，710021)

2(河南科技大学动物科技学院，河南洛阳，471003)

影响暗发酵制氢因素的研究进展*

钱卫东1，王婷2

1(陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安，710021)

2(河南科技大学动物科技学院，河南洛阳，471003)

暗发酵制氢具有产氢能力高、速率快、持续稳定、原料来源广泛且成本低等特点，易于实现规模化生产，已成为制氢领域的研究热点。文中主要介绍了对暗发酵制氢高效、持续和稳定产氢有重要影响的影响因子，如接种物、pH值、温度以及水力停留时间(hydraulic retention time，HRT)。概述了暗发酵制氢技术近年来的研究现状和其发展趋势。

生物制氢技术，暗发酵，影响因素

氢被公认为是最有发展前景的可再生清洁能源之一，是一种最具发展潜力的化石燃料替代能源[1］。暗发酵生物制氢是利用厌氧发酵产氢细菌在厌氧条件下将有机物分解转化为氢气。此过程不需要光能供应，能将产氢与有机物的去除有机地耦合在一起，而且能够进行暗发酵产氢的微生物种类繁多。暗发酵制氢是一个非常复杂的过程易受多种因素影响，如接种物、温度、pH值和水力停留时间(hydraulic retention time，HRT)等。对这些因素，研究人员已经进行了大量相关研究。本文试图对前人的研究进展进行简要的总结，为今后的暗发酵生物制氢研究工作提供科学依据及建议。

1 接种物

暗发酵产氢微生物主要是指一些在无光照条件下通过分解有机物来获得放氢能量的微生物。这些微生物广泛存在于土壤、污泥、沼泽、热泉甚至动物胃中，可以分解有机物放出氢气。因此，在混合培养系统中，用于产氢的接种物来源广泛。到目前为止，用于发酵制氢的混合菌群主要来源于厌氧消化污泥、活性污泥、好氧堆肥、土壤、湖泊沉积物、海洋潮汐污泥等自然环境中[2］。能够进行暗发酵产氢的微生物种类繁多，包括一些专性厌氧细菌、兼性厌氧细菌及少量好氧细菌，例如放氢梭菌属(Clostridium)、埃希氏肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和肠杆菌属(Enterobacter)等。其中，在厌氧混合发酵制氢过程中，产生的氢气很容易被耗氢菌如甲烷菌属(Methanogenus)、同型乙酸菌属(Homoacetogenic bacteria)和丙酸菌属(Propionibacterium Orla-Jensen)等细菌消耗[3］。因此，为了提高产氢菌产氢气产量，接种物必须经过预处理来抑制耗氢菌的生物活性，同时要保持产氢菌的制氢能力。目前对从天然接种物中富集产氢菌群进行预处理的方法主要包括以下几种:热、酸、碱、暴氧、冻融、氯仿、2-溴乙烷磺酸钠(2-bromoethanesulfonate，BESA)、碘丙烷等处理方法。

热处理接种物已经被广泛用于暗发酵制氢的启动过程[4］。热处理的温度一般在60～120°C，处理时间为15～300 min[5-7］。接种物在经过热处理之后，许多产氢菌能形成芽孢，如放氢梭菌属、芽孢杆菌属和热解糖梭菌(Thermoanaero bacterium)[8］，而不能形成芽孢的甲烷菌则被杀死，从而使产氢菌得到富集。虽然热处理被广泛用于富集产氢菌群并且显著提高了氢气产量，然而值得注意的是，该方法也具有局限性。一方面，虽然热处理能完全杀死甲烷菌，但是同时也降低了接种物中的微生物多样性，其中许多不能产生芽孢的产氢菌也同样被杀死，如埃希氏肠杆菌属和枸橼酸杆菌属(Citrobacter)[9］，这直接导致产氢效率降低[10］。另一方面，由于某些同型乙酸菌在热应激时也能形成芽孢[11］，因此热处理并不能抑制此类菌的耗氢活性，其中存活下来的同型乙酸菌继续利用氢气生成乙酸，这导致氢气产量的总体出现下降。值得注意的是，热处理获得的产氢细菌菌群的延迟时间一般较长。

一些产氢菌可以在较宽pH范围内生长，而耗氢菌中比例较大的甲烷菌对pH的变化敏感，在极端pH条件下就会死亡。因此，酸碱处理接种物能有效地抑制甲烷菌的生物活性和提高氢气产量。Chen等[12］研究发现，经酸和碱分别处理后的污泥，氢气产量相应地提高了333和200倍。此外，Cheong和Hansen也研究发现，经酸处理后的污泥的氢气产量显著提高[13］。但是，也有报道表明，经碱处理后的接种物并不能完全抑制甲烷菌生物活性，而且酸或碱处理还影响氢气生产[14-15］。出现上述不同的结果，其原因可能由于底物或者培养条件不同所致，这需要对实验条件进行综合权衡。

接种物中所占比例较大的严格厌氧的产甲烷菌对氧气和许多化学品非常敏感如氯仿和BESA，因此可以通过暴氧或者添加这些有毒的化学抑制剂来抑制该菌的耗氢活性。虽然经过曝气处理的接种物可以显著提高氢气产量[16］，但是这种方法并不能完全抑制甲烷菌的生物活性[11］。氯仿、BESA、碘丙烷和乙炔等化学抑制剂能高效地抑制甲烷菌的生物活性。其中氯仿能抑制甲烷菌利用H2/CO2或者乙酸来生产甲烷[17］，低浓度的氯仿(100 μm)便能强烈抑制甲烷菌的生物活性。Hu等[18］研究表明，0.05%的氯仿不但完全抑制了甲烷菌的生物活性，而且还显著提高了氢气产量，其原因可能是由于氯仿也能抑制同型乙酸菌的部分生物活性。值得关注的是，高浓度的氯仿会抑制产氢菌的部分生物活性，从而负面地影响了氢气产量。BESA是甲烷菌辅酶M的类似物，其中甲烷菌辅酶M只存在于细胞内，因此BESA可以专一的抑制产甲烷菌的活性。25 mmol/L的BESA就能显著地抑制甲烷菌的生物活性，并能非常有效地提高氢气产量[19］。但是，低剂量BESA(10 mmol/L)对氢气产量提高没有显著影响，可能是由于剂量太低造成的[18］。碘丙烷是类咕啉拮抗剂，它能抑制维生素B12辅酶功能，虽然它可以抑制甲烷菌的活性，但是对氢气产量影响较小，如经碘丙烷处理后其产氢能力为5.64 mol/mol(蔗糖)，而对照组的产氢量为5.17 mol/mol(蔗糖)[18］。需要注意的是，为实现氢气的工业化生产，通过使用化学抑制剂抑制耗氢菌的生物活性在经济上是不可行的，这意味着实验室阶段使用的BESA或者碘丙烷的甲烷菌抑制剂并不能用于大规模氢气的生产。

2 pH值

在暗发酵制氢中，pH值通过干扰细胞内NADH/NAD动态平衡和产氢菌的生理条件而影响发酵产氢的效率。pH会影响氢化酶的活性，并且还影响产氢菌细胞的氧化还原电位、代谢产物及其形态等方面。因此，正确控制反应体系中的pH是影响产氢菌产氢的一个关键因素。此外，pH还影响耗氢细菌如丙酸菌和甲烷菌的生物活性[20］。但是迄今为止，研究人员对于暗发酵制氢的最佳pH值范围，分歧很大尚未达成一致的结论，其原因可能是由于实验所用的底物、接种物或者培养条件的不同造成的。一般认为，暗发酵产氢的最佳pH值范围在pH 5.0～6.0[21-23］。也有许多研究发现，产氢的最佳 pH在6.0～8.0[24-26］。而且还有其他报道的最佳 pH 值，其中任南琪教授研究组在研究糖浆废水发酵产氢时，发现产氢的最佳 pH 值在4.2～4.5 左右[27-29］。Cai等研究发现、碱处理后的污泥自身发酵产氢的最佳pH为11.0[30］。但是，大部分研究结果表明，尽管发酵起始pH不同，但发酵结束后的终pH值一般都在4.0～6.0[31-32］，这主要是由于挥发性脂肪酸的快速大量产生从而削弱了发酵液的缓冲能力造成的。特别值得注意的是，pH值的逐渐下降影响了氢化酶的生物活性，从而抑制了氢气生产，因此，发酵过程中的pH值必须控制在最佳水平。此外，初始pH值不但影响氢气生产，还影响了产氢延迟时间。研究发现，当初始pH为4.0～4.5时，产氢延迟时间很长，最高可长达20h[33］。值得注意的是，尽管利用高的初始pH缩短了产氢延迟时间，但是氢气产量也受到不利影响。除此以外，由于最佳初始pH值不能反映发酵过程中的pH值实际变化，所以最佳初始pH值只是具有参考价值，因此，在发酵制氢过程中也需要控制pH值。

3 温度

温度不仅可以加快微生物细胞代谢，而且可以促进氢气从培养液中释放利于细菌进一步产氢，因此温度是影响产氢微生物活性及其氢气生产的重要因素之一[34-35］。大部分产氢微生物属于嗜温菌，厌氧菌的最适生长温度在嗜温菌生长温度范围的上限，但不同发酵产氢微生物的产氢温度也存在较大的差异。目前报道的暗发酵制氢的温度范围主要包括中温(25～40℃)、高温(40～65℃)、极端高温(65～80℃)及超高温(大于80℃)[36］。值得注意的是暗发酵制氢的反应温度通常在中温和高温条件下进行。在中温条件下，Lay等[4］通过批次试验研究市政有机固体废弃物发酵，表明氢气产量达50 mL H2/g-VS。同样，Okamoto等[37］通过批次发酵研究HSW如稻米和胡萝卜产氢特点，表明氢气产量在19.3～96.0 mL/g-VS。Valdez-Vazquez等[38］使用连续流搅拌槽式反应器(continuous stirred tank reactor，CSTR)研究市政固体废弃物发酵特点，发现氢气产量为95.14 mL/g-VS。Wang等[34］利用含有葡萄糖的废水作为底物发现，当发酵温度为40℃时，氢气产量最大，可达到275.1 mL/g-glucose。此外，高温发酵制氢比中温发酵更有利于提高氢气产量和氢气产生速率。Yu等[39］研究发现，在高温条件下，高强度稻米酿酒厂废水连续发酵制氢的氢气产量明显高于中温和低温时的氢气产量。Morimoto等[32］研究发现，葡萄糖发酵时的最高氢气产量出现在55℃。Valdez-Vazquez等[38］通过半连续产氢试验详细比较了市政固体废弃物有机组分中温和高温发酵的产氢特点，表明高温发酵时的氢气含量(58%)显著高于中温时的氢气含量(42%)，并且氢气产量也显著优于中温发酵。其中中温发酵的氢气产量只有理论氢气产量的37%，而高温发酵的氢气产量则高达83%。Cheong等[40］利用批次试验证明葡萄糖发酵产氢高温时的氢气产量也明显高于中温时的产量。然而，通过实验一些研究人员发现极端高温时的氢气生产比中温和高温发酵产氢更有利[41］。据报道，在极端高温条件下(70℃)，氢气产量达到了4 mol/mol-glucose，而在中温和高温条件下的氢气产量只有2 mol/mol-glucose左右[42］，因此尚未看出常温发酵制氢的优势。其主要机制在于极端高温发酵可以有效的杀死病原菌，减少甲烷菌等耗氢细菌的污染。需要指出的是，从节能的角度考虑采用高温发酵耗能巨大，这可能限制了该技术在实际工程中的应用。

4 水力停留时间

对于利用器连续流搅拌槽式反应器(continuous stirred tank reactor，CSTR)进行生物制氢，HRT 是连续产氢过程中的一个重要调控因子。缩短HRT可以降低耗氢菌对氢气产生的不利影响，减小反应器体积和降低成本[43］。从目前的研究看，厌氧反应器控制的水力停留时间通常取决于产氢原料(底物)，并且水力停留时间的差异与反应器结构形式的差异密切相关。目前进行得理论研究主要使用纯底物(如葡萄糖、蔗糖、淀粉和纤维素等)，而生产性应用通常为非常复杂的底物。研究发现，在CSTR中运行蔗糖发酵，最佳的HRT一般在8～12 h[43］。然而，淀粉发酵的最佳HRT一般在12.7～20.2 h[44］，纤维素发酵的HRT则延长到3 d[45］。表明随着底物复杂程度的上升，HRT也相应延长[46］。在连续产氢发酵过程中，pH和HRT是一个相互偶联的过程参数。在中温和高温发酵条件下，这两个参数的最优组合可以有效的分开产氢菌和耗氢菌。Fang和Liu[21］在葡萄糖连续产氢的过程中发现，在HRT为6 h和pH6.0时，仍有甲烷的产生，他们推测甲烷菌可能吸附在了CSTR的内壁上。然而，Lin等[47］在 pH6.8和 HRT2～12h的条件下运行CSTR发酵蔗糖超过350 d，并没有检测到甲烷菌。Fan等[48］在CSTR中利用热处理牛粪堆肥作为接种物发酵啤酒厂废弃物，在pH6.5和HRT 18h的条件下连续产氢10个月，也没有检测到甲烷。虽然缩短HRT可以有效的去除甲烷菌，但是它仍然不能阻止其它耗氢菌对产氢的不利影响如同型乙酸菌、丙酸菌和乳酸菌。研究发现，同型产乙酸作用、丙酸生产和乳酸生产主要出现在pH 5.0以上[49］。因此，维持系统的较低的pH将更有利于氢气的生产和提高氢气产量[21］。Khanal等[50］利用连续批次反应器研究蔗糖发酵产氢表明，pH从5.2降低到4.8更有力于提高氢气产量。任南琪教授等[51］在研究糖浆废水连续产氢过程中，发现pH 4.0～4.5和HRT 4～6h为乙醇型发酵的最佳条件在pH4.9时，没有氢气产生。

5 展望

由于人类对能源需求日益增长，致使赖以依存的化石能源将日益枯竭，亟需寻求可再生、高效、清洁能源来替代，而氢气正是目前最理想的清洁燃料之一。因此，氢气必将成为后化石燃料时代的能源主要供应方式之一。目前，无论从环境保护，还是资源可持续发展的角度来看，暗发酵法生物制氢技术具有很大的发展潜力。但是，到目前为止，暗发酵制氢工业化进程仍处于起步阶段，其在若干研究领域尚需进行更深一步的研究。

5.1 接种物的选择

虽然接种物来源的广泛性，但是接种物性质上的不同，很大程度的影响了产氢发酵过程。因此为了提高氢气产来能够，针对特定的底物必须选择合适的接种物。虽然热处理已被证明是一个非常有效的从厌氧消化污泥中富集产氢菌群的方法，但是它只能富集能形成芽孢的产氢菌，其中一些产氢能力可能较强但不能形成芽孢的产氢菌则被杀死。

5.2 过程参数系统集成分析

其次，系统地研究关键过程参数对氢气生产的影响。到目前为止，文献中报道的结果大部分都是来自于某些培养条件下数据如温度和pH，为数据比较与分析带来了相当大的困难，这需要对系统关键过程参数进行综合统筹，从整体水平上系统地研究各种参数。

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ABSTRACTBiohydrogen production through dark fermentation has been a research focus，due to its high-capacity and high-speed of biohydrogen production，its sustainability and stability，simple operation of its reaction device and a wide range of low-cost renewable raw materials.In this paper，influencing factors including inoculum，temperature，pH and hydraulic retention time which are important to high efficient，continuous and stable hydrogen production by dark fermentation are summarized and the progress of biohydrogen production is introduced.

Key wordsbiohydrogen production technology，dark-fermentation，influencing factor

Progress on Investigation of Influencing Factors for Bio-hydrogen Production Through Dark-fermentation

Qian Wei-dong1，Wang Ting2
1(School of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China)
2(Animal Science and Technology School，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China)

博士，讲师。

*国家自然科学基金(31100040)，陕西省教育厅专项科研计划项目(11JK0624)，陕西科技大学博士科研启动基金(BJ10-15)

2012-01-11，改回日期:2010-02-23