乳酸菌食品级表达系统的研究进展

苏松坤， 晏励民， 刘 芳

（浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058）

乳酸菌包括大量革兰氏阳性球菌和杆菌，在发酵食品的生产和保存中广泛应用。由于乳酸菌是安全级食品，所以大量的菌在基因水平上都进行了修饰，并且通过克隆技术介入特定的基因来改善乳酸菌本身的性状，但是，传统乳酸菌表达外源蛋白的效率仍然比较低。同时，目前报道的乳酸菌表达载体系统所使用的选择标记均是抗生素抗性基因，而抗药性基因将不断向环境中漂移扩散，这对生物安全性造成了严重危害[1]。鉴于传统乳酸菌基因表达系统的上述弊端，国内外学者一直致力于获取高效且对人和动物无毒副作用的表达系统，也就是所谓的食品级表达系统。早在1987年，Willem就提出了乳酸菌的选择标记必须采用食品级这一观点[2]，之后，乳酸菌食品级表达系统作为高效而安全的表达系统得到了广泛的应用。作者就乳酸菌食品级表达系统在食品、医学、保健品上的应用的最新进展进行了综述。

1 乳酸菌食品级基因表达系统必须具备的基本条件

1.1 表达载体必须是食品级

乳酸菌食品级表达系统所使用的载体必须是食品级的，不能含有非食品级功能性DNA片段。长久以来，人们构建了大量具有抗生素抗性标记的载体用于乳酸菌基因水平上的修饰。但由于抗生素抗性基因存在安全隐患，许多用于乳酸菌的食品级选择标记已经发展起来，这些选择标记是基于生物的天然性质，如糖发酵、氨基酸代谢、核苷酸生物合成和细菌的免疫抗性[3]。同时，一些基于环境压力的新的选择标记也得到开发，如热休克蛋白、金属抗性基因和细菌素抗性基因。Yin Sheng等采用胆汁盐水解酶基因构建了乳酸菌的食品级表达载体[4]。在研究中，将能够耐受压力和可进行安全选择的表达载体系统应用于食品工业，得名为“食品级”表达载体[2]。

1.2 宿主乳酸菌必须是食品级微生物

构建的“食品级”表达载体必须要转化到宿主菌中才能发挥功能，所以转化表达载体的宿主菌也必须具备生物安全性，我们一般都使用安全的、遗传背景清楚且稳定的食品级微生物，如乳酸乳球菌（Lactococcus.lactis）、乳酸杆菌（Lactobacillus）及其它已经在食品工业中得到长期而广泛应用的菌类。可以使用先进的分类方法对宿主菌进行鉴定，并通过适当的分子生物学手段阐明表达宿主的遗传组成，如核苷酸测序、PCR扩增、DNA杂交等技术。此外，该宿主菌在生理状况下，要能够稳定在食品中定植或进入人和动物的消化道，并且能顺利通过消化道的各种理化因素和酶屏障[5]。

1.3 表达所使用的诱导物必须是食品级

乳酸菌的表达系统按照基因组内启动子的类型可以分为组成型表达系统（Constitutive expression system）和诱导型表达系统（Controlled/inducible expression system）。在乳酸菌中大量的蛋白质生产已经通过乳酸乳球菌组成型的启动子获得[2]。但是连续的高产量表达会导致细胞内蛋白质的积累、聚集甚至蛋白质的沉淀，这些都对细胞有害。为解决这些问题，研究了诱导型表达的启动子，通过这些启动子，基因表达可以被诱导物、抑制物、环境因素控制，比如pH、温度和离子浓度[2]。乳酸菌食品级表达系统中所使用的诱导物必须是食品级的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、乳链菌肽等可被人食用的物质[5]都能用来做诱导物。

2 乳酸菌食品级表达和标记系统

2.1 利用乳糖作为选择标记的表达系统

乳糖是一类常用的食品级选择标记。MacCormick等首先将实验菌株L.1actis MG5276的质粒敲除，然后将完整的乳糖操纵子整合到其染色体上，通过双交换使lacF基因失活，结果该菌株丧失了利用乳糖的能力（Lac-）。之后再将克隆有lacF基因的质粒转到上述菌株中，该菌株恢复了利用乳糖的能力（Lac+）[6]。 Platteeuw 等将大肠杆菌（E.coli）中的β-葡糖醛酸酶基因（gusA）克隆到L.1actis乳糖操纵子lacA启动子的下游，然后转到缺失受体菌中，转化后该菌能够利用乳糖[7]，证明了乳糖可以作为一种有效的选择标记。此外，Takala等构建了以乳糖合成酶为选择标记的乳酸菌表达载体，并命名为PLEB600[8]。

2.2 Nisin诱导的食品级基因表达系统

Nisin是由乳酸乳球菌产生的一种小分子抗菌肽，由34个氨基酸组成，相对分子质量为3 510。Nisin对人体无毒副作用，进入消化道后被其中的蛋白酶作用从而失活，不会影响肠道的菌群平衡。FAO/WHO于1969年接受Nisin作为一种食品添加剂，现在Nisin已作为一种天然防腐剂在食品工业广泛使用。Nisin的以上特性决定了它可以作为一种食品级诱导物在食品级表达系统中诱导异源蛋白的表达。

在Nisin自动调节过程中，Nisin通过一个典型的两组分调节系统诱导了生物合成基因簇的转录，包括组氨酸蛋白激酶nisK和反应调节蛋白nisR[9]。当Nisin诱导了NisK，NisK发生自动磷酸化并且进一步将磷基团转移到细胞内的反应调节蛋白nisR，nisR起到激活转录启动子nisA/F的作用，并且诱导基因表达[10]。

基于Nisin生物合成的自动调节机制，de Ruyter等在1996年构建了NICE系统[11]。nisA启动子被分离用于构建质粒，nisR和nisK基因被结合到合适的宿主菌的染色体上，当一个基因被克隆到一个质粒的PnisA基因下游并转化到含NisinRK基因的菌中，克隆基因的表达可以被Nisin的加入而激活，Nisin首先诱导PnisA的转录，接着启动基因表达。通过双组分调节系统，表达基因的产物会在细胞中累积，也可以被分泌到细胞外，这依赖于构建过程中一个信号序列的存在与否[12]。许多报道证明了NICE系统在LAB中表达异源蛋白的多功能性和高效性[12-13]，其诱导效率可超过1 000倍以上[14]。

2.3 其它常用的食品级表达系统

以盐为诱导物的表达系统也较为常用。Sanders等分离了一个氯化盐诱导型乳酸乳球菌启动子，并采用缺失作图、核苷酸序列分析和引物延伸鉴定了这个盐诱导启动子，并用该启动子成功表达了乳酸乳球菌Cre重组酶[15]。

利用乳酸菌发酵产乳酸，发展了pH诱导的表达系统。从乳酸乳球菌中分离到受pH调节的启动子。该启动子（P170）受低 pH、低温等因子的正调节[5]。Madsen等对其进行了缺失突变，结果使P170的pH诱导作用提高150倍[16]。

此外，嘌呤、细菌素、抗金属离子和噬菌体等作为选择标记在乳酸菌食品级表达系统中也有一定程度的应用[1]。

3 乳酸菌食品级表达系统的最新应用

食品级乳酸菌系统因其高效表达的特点和应用性强的特征，很多蛋白质（酶、膜蛋白、细胞因子等）已经在乳酸菌体内得到表达应用，而其中利用乳酸菌制成的微生态制剂是广泛使用的保健品之一。LIU等将肠道菌素P基因通过食品级表达系统在乳酸球菌中进行细胞外异源表达，得到了与肠球菌LM-2中的天然肠道菌素P相同相对分子质量、具有生物活性的肠道菌素P，标志着食品级系统表达水平的显著提高[17]。近些年，食品级表达系统活跃于生物、食品、医药等各个研究领域，从最初的少数的几种宿主菌株及与其相适应的质粒载体，到现在品种丰富且高效的食品级表达系统，从之前数量有限的、常见的表达产物，到现在各种营养食品、医药用品的层出不穷的表达产物的出现，乳酸菌食品级表达系统正发挥着越来越重要的作用。Neuter等构建了一种新的食品级表达系统—基于pSIP表达载体，以同源丙氨酸消旋酶基因作为选择标记，以胚芽乳杆菌为宿主菌的表达系统，这个新系统适用于食品工业的添加剂和成分生产[18]。食品级的乳酸菌工程菌在食品、生物制药等领域的有着广阔的应用前景和商业价值。接下来，就乳酸菌食品级表达系统在食品、医学和保健品上的最新应用做一归纳。

3.1 乳酸菌食品级表达系统在食品上的应用

GL Douglas等在L.acidopbilus染色体上插入编码β-半乳糖苷酶的基因[19]，构建了产β-半乳糖苷酶的菌株，该重组菌应用于奶业生产中，提高了乳糖的水解率，从而提高了乳糖在人体中的吸收利用率，重组后的含风味酶基因的乳酸菌在食品生产与加工中不仅可以改善食品风味，还可以将一些合成营养物质的基因导入乳酸菌体内，生产出含高蛋白质的营养食品。

在发酵牛奶和奶酪的生产中，乳酸乳球菌菌株是一种在经济上和科技上都非常重要的乳品前体培养物[20]。雷特氏乳酸球菌亚种MG1363是一种穿梭质粒型菌株，在遗传学和生理学等领域都有非常广泛的应用。该菌株中的dar基因是编码二乙酰还原酶的基因，Karakas-Sen和Akyol将dar基因克隆在食品级表达载体pMG36e中。编码二乙酰还原酶的基因在菌株MG1363中超表达，菌株新陈代谢的终产物在葡萄糖培养基上生长，从而获得了二乙酰还原酶产物。而且，超表达dar基因的菌株和野生型菌株被用作奶酪生产中的前体培养物。与野生型菌株相比，在奶酪中发酵的两个星期中可以检测到不同水平的代谢终产物[21]。

3.2 乳酸菌食品级表达系统在医学上的应用

乳酸菌能够寄生于胃肠道，并被传送至活体的黏膜水平，在人体临床试验中证实，乳酸菌可以减轻肠炎等疾病，从而提供了使用这种菌来治疗其他疾病的可能性[22]。乳酸菌的这些特性使其能够成为一种良好的生产药物蛋白的重组菌[23]。

孙强正等将Mn-SOD基因克隆至食品级表达载体Psh91中，将该载体转入乳酸乳杆菌中，在重组菌L.lactis MBP71成功表达了锰超氧化物歧化酶[24]。SOD具有很强的抗氧化能力，目前已在化妆品、食品及保健品等领域应用，并在一些疾病（如肿瘤、炎症、自身免疫性疾病以及辐射损伤等）的治疗中显示了良好的应用前景[25]。而食品级乳酸菌的表达产物与传统方法中以大肠杆菌为宿主菌的产物相比，不需要经过复杂的纯化过程就可以达到食品医药标准，为锰超氧化物歧化酶的应用提供了更广阔的空间。

从病原菌、病毒和寄生虫中分离出来的许多抗原已经在重组乳酸菌中生产出来[26-28]。最先构建的生产疫苗的重组乳酸菌是乳酸乳球菌MG1363，来生产破伤风毒素抗原[29]。从这之后就有了很多用不同种乳酸菌作为细胞工厂的例子，包括胚芽乳杆菌和干酪乳杆菌。两项近期研究显示，当抗原通过重组乳酸菌表达，融合入树突状细胞靶向肽[30-31]，就可以测定增长的免疫力水平。嗜酸乳杆菌NCFM和加氏乳杆菌ATCC33323表达树突状细胞靶向肽，融合炭疽杆菌保护性抗原之后让小鼠口服，提供小鼠100%的抗炭疽能力，清晰的显示出与简单的抗原呈递（30%的抗炭疽能力）有明显的差异[30-31]。

患有乳糖不耐症的个体，在摄入乳糖之后往往会出现腹泻症状，而β-半乳糖苷酶可以帮助机体更好地使用乳糖，促进肠道菌株中的乳糖耐受性。Jingjie Li以乳糖不耐症的小鼠为模型，将内生的β-半乳糖苷酶基因克隆入乳酸乳杆菌MG1363菌株中，通过让小鼠口服MG1363菌液来进行试验。结果显示，在服用菌液之后的6 h内，总排泄物质量减少，肠道的运动性降低。这是乳酸菌食品级表达系统治疗乳糖不耐症的成功应用[32]。

Gao等使用食品级表达载体在乳酸乳球菌NZ9000中功能性地表达小鼠胰岛素类似物Ι类生长因子（IGF-I）。小鼠胰岛素类似物Ι类生长因子编码序列被插入食品级表达载体pLEB688，转化进入Lc.lactis NZ9000，通过SDS-PAGE和west blotting进行分析和验证，证明该重组蛋白具有生物活性，促进了NIH3T3的细胞增殖。小鼠胰岛素类似物Ι类生长因子在乳酸菌中表达之后被植入培养基中，在终产物质量浓度为100 ng/mL时，促进NIH3T3细胞增殖的能力达到最佳水平[33]。

3.3 乳酸菌食品级表达系统在保健品上的应用

乳酸菌在保健品方面的应用主要是作为微生态制剂，微生物制剂中广泛使用的益生菌就是乳酸菌。市场上用于微生态制剂的菌种（包括乳酸菌）大多数都是野生菌株，而野生菌株所含有的抗药因子的转移，将对经济、社会和生态造成潜在的危害[34]。食品级乳酸菌不含有抗药性因子，排除了野生菌株造成的潜在危害。张丽芳等采用标准药敏纸片琼脂扩散法 （K-B法），以金黄色葡萄球菌ATCC25923作为标准对照，研究了15株乳酸球菌、14株乳酸杆菌、5株双歧杆菌对8大类19种常用抗生素的敏感性，为研制益生菌食品级微生态制剂提供了科学依据[35]。乳酸菌微生态制剂能改善食物酸碱度、增加食欲、促进消化代谢、增强免疫力、保护生态环境，具有良好的应用前景。

4 展望

目前，多种食品级基因表达系统正在乳酸菌中建立起来，我们可以把一些与营养保健或疾病治疗等相关的基因导入这种系统中制成制剂或疫苗，直接口服，从而简化或免除了一般基因工程所需的复杂繁琐的分离纯化过程，为基因工程生产安全廉价的生物制品提供了一种新思路。

在蜂学研究领域，食品级表达系统的应用还比较少，几乎还是空白。但是其潜在的应用价值还是值得我们研究和利用。蜂王浆中的主要王浆蛋白（Major Royal Jelly Proteins，MRJPs）占总蛋白质质量分数的46%～89%，是蜂王浆的主要成分。研究表明，MRJPs是由同源性很高的一系列蛋白质组成的蛋白质家族，这一家族共有9个成员。大量实验证明，蜂王浆具有重要的医疗保健作用和生物学功能，这可能与王浆中的MRJPs密切相关[36]。因此，我们可以试图将编码王浆蛋白的基因导入乳酸菌食品级系统中，让其在乳酸菌中获得高效表达，这样制成的乳酸菌食品不仅美味可口，而且极富营养价值。这样也丰富了乳酸菌表达系统在食品工业领域的应用。

鉴于乳酸菌诱导表达系统的诸多优势，乳酸菌“食品级”高效表达载体系统无疑将在发酵工程和口服功能性生物制剂方面得到巨大的发展，乳酸工程菌及其表达产物可以应用于食品、医药、保健品和工业领域，有巨大的应用前景和潜在的商业价值。

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