微生物对食品安全的危害及其快速检测技术

夏爱萍，龚鸿萍，郑睿行

（衢州市质量技术监督检测中心，浙江衢州，324002）

食品从生产、加工、储存、运输、销售，到食用的整个过程，每个环节都容易受到各种途径的污染，产生对人体有害因素。因此食品的安全问题，向来被每一个消费者所关注。食品的污染，主要分两类：一类是化学物质对食品的污染, 主要表现为化学残留物、重金属污染物。另一类是病原微生物所引起的食品污染，也称生物性污染。这一类状况最易发生。微生物导致危害的可能性远远超过其他来源的危害，它可引起因食品中细菌大量繁殖而导致食用者感染型中毒或因细菌繁殖产生菌毒素引起的毒素型中毒。细菌感染型中毒潜伏期较长，通常为10 多个小时，伴有发烧；而毒素型中毒则仅为2～4小时，很少发烧。

1 对人体健康危害较严重的致病菌

1.1 沙门氏菌

沙门氏菌为革兰氏阴性的不产孢子的杆菌，主要分布在动物的肠道中，作为肠道菌群，它们会随着粪便排泄出来，再由昆虫和其它动物传播到其它地方。沙门氏菌中毒往往源自病死牲畜肉、变质动物性食品和蛋类，其所致的中毒是最常见食物中毒之一。中毒者会在进食后短期内出现急性胃肠症状，如恶心，频繁性呕吐，腹痛、腹泻；重者可发生高热、脱水、昏迷、抽搐，很快死亡。

1.2 大肠杆菌

大肠杆菌在正常人的肠道内存在，一般情况下不致病，但食用被该菌污染的食物时就会致病。大肠杆菌进入胃肠后会继续繁殖，产生较重呕吐、恶心、腹痛、腹泻等胃肠症状,引起胃肠粘膜充血、水肿等病变。大肠杆菌引起的感染为最严重的食源性疾病之一。

1.3 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌存在于海水中，因此各种海产食物的带菌率很高。当食用未煮熟海鱼、海蜇，以及食用盐腌制的并已被污染的肉类、蛋类、鱼类、咸菜时，可引起中毒。中毒者胃肠症状严重，恶心呕吐，腹痛，特别是肠糜烂、充血、水肿，并出现脓血水样便，甚至发生休克、溶血现象。

1.4 李斯特菌

李斯特菌是革兰氏阳性、不产孢子和不耐酸的杆菌，它们在自然界的分布广泛，可以在腐烂的植物、土壤、动物粪便、污水、青贮饲料和水中被发现，部分正常人体内也可带有此菌。中毒原因主要是奶及乳制品、肉制品、水产品和水果蔬菜等未经煮熟、煮透，冰箱内冷藏的熟食品、乳制品取出后直接食用所导致。中毒者在8～24 小时内出现恶心、呕吐、腹泻等症状。严重的可表现为败血症、脑膜炎等，也可引起心内膜炎。

1.5 金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌普遍存在于自然界中,正常人粪便中也可分离出此菌。金黄色葡萄球菌繁殖产生肠毒素常见于陈置米饭、淀粉类食品与奶制品，中毒者表现出反复呕吐、剧烈腹痛等症状。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

1.6 肉毒梭状芽孢杆菌

肉毒杆菌食物中毒多由食用含有肉毒杆菌外毒素污染的食物而发生。此菌普遍存在于土壤家畜粪便中，可附着在水果、蔬菜、罐头、火腿、膜肠肉里而大量繁殖外毒素，成人致死量为0.01mg。肉毒毒素主要侵犯神经系统，中毒者会产生复视、肌肉麻痹、呼吸困难等症状，并伴有脑水肿和脑充血。

1.7 变形杆菌

变形杆菌在食品中能产生肠毒素，并且可以使蛋白质中的组氨酸脱羧而形成组胺,从而引起胃肠炎或过敏性反应。中毒所引起的疾病可呈恶心、呕吐、腹痛、腹泻、头晕、头痛及发热等症状或皮肤潮红、头痛、酒醉貌、荨麻疹等过敏反应的表现[1]。

2 食品微生物快速检测技术

2.1 气相色谱法

其原理是将微生物细胞经过水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化处理后，使之分离尽可能多的化学组分供气相色谱仪进行分析。不同的微生物所得到的色谱图中，通常大多数的峰是共性的，只有少数的峰具有特征性，可被用来进行微生物鉴定，分析检测各种常见细菌、酵母菌、霉菌等。

2.2 “既用胶”测定法[2]

把1ml食物样品倾入一盛有无菌液体培养基的试管中，混匀后再将混合物倒入一个装有胶质的特殊培养皿中。混合物与胶质接触后便形成琼脂相似的复合物。经培养后便可计数菌种及数量。该系统是包装好的产品，用时不需灭菌，极适合野外测定。目前，这种系统正在受到美国AOAC（官方农业化学家协会）的鉴定。

2.3 以生物化学手段建立的快速检测技术

2.3.1 微生物专有酶快速反应系统的检测技术

微生物专有酶快速反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机地结合起来，并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个主要发展方向。

2.3.2 常规的致病微生物检测技术

不同病原体的化学组成或所产生的代谢产物各异，利用微生物（主要是细菌）的不同生化和生理特性，可以对细菌进行鉴定。生化鉴定是检测细菌最常用的方法。

2.4 以免疫学方法建立的快速检测技术

免疫检测的基本原理是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。不同的微生物有其特异的抗原，并能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测微生物的特异抗原，也可利用微生物抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。

2.4.1 免疫荧光技术

免疫荧光技术（Immunofluorescence Technique）是用荧光素标记的抗体检测抗原或抗体的免疫学标记技术，又称荧光抗体技术。所用的荧光素标记抗体通称为荧光抗体，免疫荧光技术在实际应用上主要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加己知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在检样上滴加己知的细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体。

2.4.2 酶免疫测定技术

酶免疫测定（Enzyme immunoassay, EIA）根据抗原抗体反应是否需要分离结合的和游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。非均相法较常用，包括液相免疫测定法与固相免疫测定法。固相免疫测定法的代表技术是ELISA。ELISA 技术是抗原或抗体吸附到固相载体上作为一种试剂来检测标本中抗体或抗原的一种方法。根据反应原理，加入某种酶标记的抗体或抗原，洗涤除去未结合物，加入该酶的底物，酶催化底物生成有色产物，产物的量与标本中受检物的量有关，根据反应颜色的深浅可定量测定。

2.4.3 免疫印迹技术

免疫印迹（Immunoblot）法分三个步骤：第一，SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。将蛋白质抗原按分子大小和所带电荷的不同分成不同的区带。第二，电转移。目的是将凝胶中己分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。第三，酶免疫定位，该步的意义是将前两步中己分离，但肉眼不能见到的抗原带显示出来。将印有蛋白抗原条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标记的第二抗体反应后，再与能形成不溶性显色物的酶反应底物作用，最终使区带染色。本法综合了SDS-PAGE的高分辨率及ELISA 的高敏感性和高特异性，是一种有效的分析手段。

2.4.4 免疫组织化学方法

免疫组织化学方法是应用免疫学中的抗原抗体反应，借助可见的标记物，在组织原位显示抗原或抗体的方法。常用的免疫组织化学方法有荧光免疫和酶免疫组化技术、金标免疫组织化学技术和免疫电镜，该技术特点是对细胞涂片、印片、组织切片进行处理和染色镜检。免疫组化技术弥补了上述血清学诊断方法的不足，使得在细胞或组织内检测病原微生物成分成为可能。对于在宿主组织液中微量表达或不表达抗原、抗体的微生物，免疫组化具有较好的辅助诊断价值。利用免疫组化技术，还能观察被侵犯组织致病微生物繁殖和对组织破坏情况。

2.5 活细胞计数检测

自动旋转平板和激光菌落扫描计数法，在均匀薄层琼脂营养基表面，以阿基米德螺旋线方式将液体样品从中心到边缘均匀涂在平板上。经过培养在计数格区间内计数，或用激光计数器来扫描平板，以透过光的强度来检测菌落的存在。

PetrifiumTM系统用可重新水化的营养成分取代琼脂倾注平板。把这种营养成分和一种胶态试剂一起嵌入在一系列薄膜上。取1mL液体样品滴于膜系统中央，重新水化的培养基便可作为微生物生长的支持物，经过培养后，便可像常规平皿计数一样直接在膜系统上对菌落进行计数。Petrifium2000系列从菌群鉴定到结束只需培养8h。

Redigel系统（RCR Scientific）由多种营养成分与果胶混合并装入试管，混匀后无需溶解凝胶。试样直接加入试管后倒入覆盖有一层钙质的培养皿中，倒入液体与钙质形成果胶钙。培养后进行菌落计数。

疏水网膜（HGMF）技术是常规平皿划线方法的改进。样品用疏水网膜过滤，要检测的微生物被捕获在疏水网膜的小格中。在接种后的疏水网膜上倾入适当的琼脂，在适当时间培养后即可计数。由于菌落都是正方形，人工或机械计数都很方便。可用于酵母和霉菌计数、沙门氏菌检测、大肠杆菌/大肠菌群检测。

2.6 PCR检测技术在食品病原微生物检测中的应用

PCR技术由于其高度敏感性、特异性等特点使其在食品微生物检测中得到了广泛应用，而且由此衍生出了多种方法进行检测。现在经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR、多重PCR等，它们都是针对于食品中病原菌的特异性靶基因，通常是致病基因进行检测。PCR技术和其它检测技术(如核酸杂交等)联合应用，展现了良好的前景。最新发展的荧光定量PCR技术更能检测样品中病原菌的数量，如对李氏杆菌[3]、沙门氏菌[4]、肉毒杆菌[5]、大肠杆菌O157∶H 7[6]等的检测也都取得了良好效果。

2.7 生物芯片技术在食品病原微生物检测中的应用[7]

生物芯片技术是近年来兴起的一项综合性的高新技术，它以微机电系统技术和生物技术为依托，将生命科学研究中的许多不连续过程（如样品制备、生化反应、检测等步骤）集成并移植到一块普通邮票大小的芯片上去，并使这些分散的过程连续化、微型化，以实现对大量生物信息进行快速、并行处理的要求。基因芯片具有高通量能并行检测的优点,仅靠一个实验就能检测出大量的未知菌，所以基因芯片技术在微生物研究领域的成功经验为其应用于食品微生物特别是致病菌的检测打下了基础[7，8]。

2.8 传感器技术在食品病原微生物检测中的应用

生物传感器主要是将生物、化学、热变化、光效应、质量信号等转化为电信号的技术。目前已经商品化的传感器有酶传感器、免疫传感器、微生物传感器、DNA杂交传感器、细胞器传感器、仿生传感器、分子印迹传感器等。光纤DNA生物传感器是DNA生物传感器中发展最晚，技术最新的一类，它的作用机理是利用石英的表面特性先接上一个连接物，然后将ssDNA或cDNA连接在光纤端面上，与目的基因进行杂交，杂交后的双链DNA经杂交嵌合剂产生的光效应而被检测。目前光纤传感器已经应用到了测定污染食品中的大肠杆菌O157∶H 7、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌中。

2.9 流式细胞术FCM 在食品病原微生物检测中的应用

该技术是用流式细胞仪对细胞悬液进行自动快速定量分析和分选的新技术，具有速度快、精确度高、记数细胞量大以及参数分析等全面测量细胞和分选细胞等优点。由于FCM 检测到的荧光强度的强弱与DNA片段的大小成比例，根据荧光浓度的直方图就可知道细菌的DNA指纹图谱，从而确定细菌的种类。现在该技术已经能够检测纯化的DNA可达pg级水平，在10min内可以完成数据的收集和分析。近年来在临床实验室已经逐步用于病毒、细菌的检测、计数、鉴定等。FCM 目前已经发展到可测定DNA片段的大小，被认为是一种鉴定细菌很有发展潜力的技术。另外FCM 结合免疫荧光抗体检测技术更能促进病原菌的特异性快速检测。

2.10 基因探针技术在食品病原微生物检测中的应用

该技术是从细菌中提取各自稳定、特异的DNA片段，经克隆提纯，再将此DNA片段标记上可检测的指示剂，如放射性同位素、荧光物质等使之成为特异性的DNA探针。细菌经过处理后固定于另一固相表面上，经洗涤加入DNA探针进行杂交，DNA探针可以与同源性的靶DNA进行互补性结合，依据指示剂不同,选用合适的方法进行检测。而且选用这个技术可以进行菌种和毒种鉴别。

最近又设计了一种DNA 指纹图谱自动分析系统——Ribo PrinterTM(Dupont de Nemours公司产品）。具体操作是从细菌细胞中提取DNA,接着用限制性酶将DNA降解成片段，DNA片段通过电泳得到分开， 再转移至杂交膜上与DNA探针杂交。由于引入了化学发光标记物，杂交片段发出的光线被相机捕获，得到的核酸图谱与其他贮存的DNA核酸碱基序列进行比较，通过核酸匹配分析可以对微生物进行鉴定。

微生物在食品中存在着很大的不安全性，会产生很多不安全因素，因此对食品中病原菌的快速检测有着十分重要的意义。

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[2]唐春林，车振明.食品微生物快速检测技术研究进展[J].食品工程,2006,1:52-55

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[4]Perelle S, Dilasser F, M alorny B, et al. Comparison of PCR -ELISA and LightCycler real-time PCR assays for detecting Salmonella spp.in milk and meatsamples[J].M ol CellProbes,2004,18(6):409-420

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