副猪嗜血杆菌病的研究现状

姜宝奎 刘宴博 （山东省莱阳市畜牧兽医局 265200）



副猪嗜血杆菌病的研究现状

姜宝奎 刘宴博 （山东省莱阳市畜牧兽医局 265200）

随着猪场规模化、集约化程度的不断提高，猪群饲养密度越来越大，呼吸道疾病逐渐成为继繁殖障碍性疾病、胃肠道疾病之后危害养猪业的三大症候群之一。特别是近年来，猪“高热性”呼吸道疾病的蔓延和迁延不愈，尤其是副猪嗜血杆菌(，Hps)引起的以猪多发性浆膜炎、关节炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的传染性疾病给养猪业带来巨大的经济损失[1]。随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病，我国20 世纪90 年代才开始对该菌进行研究，而且主要集中在细菌分离鉴定、血清学鉴定、药物敏感性试验和临床防治研究等方面。本文就副猪嗜血杆菌的病原学、流行病学、致病机理、菌株的分离鉴定及诊断和防制措施等方面的研究进展进行了综述。

1 病原学

早在1910年，德国科学家Glsser就发现了副猪嗜血与猪的多发性浆膜炎和关节炎之间的联系，最早Hjarre和Wramby将病原体称为猪嗜血杆菌()，而Leece将病原体称为猪流感嗜血杆菌()。在证明了该菌生长时不需要X因子(血红素和其它卟啉类物质)的基础上，该菌更名为副猪嗜血杆菌[2]。Hps是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD依赖型、革兰氏阴性细小杆菌，兼性厌氧。具多种不同形态的细菌，从单个球杆状到长的、细长的以至丝状菌体，常可见荚膜。其在巧克力培养基上培养24～48 h生长较差，为光滑型、灰白色透明、直径大约0.5mm菌落。如与金黄色葡萄球菌共同培养时，HPS在葡萄球菌条状菌苔附近呈卫星生长，生长良好，菌落直径可达1～2 mm。HPS在血液琼脂上呈小而透明的不溶血菌落，在加NAD、马血清的M96支原体培养基或加NAD、马血清和酵母浸出物的PPLO培养基上生长良好。生化反应为尿酶试验阴性、氧化酶阴性、接触酶试验阳性，可发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麦芽糖等。

Ruiz A等研究表明，外膜蛋白(OMP)与Hps的毒力有关，从健康仔猪与患病猪分离的Hps OMP不同，有多发性浆膜炎和关节炎症状的猪分离的Hps OMP基本相同。OMP蛋白质共有8种，大小分别约为9.2万，8.8万，5.3万，6.0万，4.6万，3.7万，3.1万及1.5万Da[3]。Charland等证明猪血清中转铁蛋白受体的存在，并分析两种转铁结合蛋白(transferrin bindingprotein, Tbp)的多肽结构。TbpA和TbpB能够特异的捕获宿主的转铁蛋白，并将铁转运到细胞浆中，以提供细菌生长所需。Tbp在Hps感染宿主动物以引起发病起到决定性作用[4]。Lichtensteiger等指出，一种神经氨酸酶与细菌的宿主细胞内生长活性有关。该酶存在于细菌对数生长末期，提供细菌保持活力的非离子态钙，他们随后在Hps的分泌液中提纯了这种有潜在毒力的神经氨酸酶，这进一步推动了Hps致病因子的研究[5]。

2 流行病学

引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌有3 种，即胸膜肺炎放线杆菌(AP)、猪嗜血杆菌(Hs) 和副猪嗜血杆菌(Hps)。副猪嗜血杆菌自1910年以来就作为病原菌而被认为是猪Glasser病的病原体。然而，直到90 年代才对其发病和防制进行了深入研究。由副猪嗜血杆菌引起的急性型疾病早期症状包括发热、食欲不振和厌食，也可见到呼吸困难、关节肿胀、跛行、运动不协调、发绀、不愿活动以及死亡[6]。耐过急性发病的猪表现为被毛粗乱、咳嗽、呼吸困难和生长迟滞。有人报道了副猪嗜血杆菌引起的非典型症状，如猝死(通常由败血性休克所致) 和非特异性呼吸道症状(呼吸困难、咳嗽) 和生长迟滞。急性型疾病的特征性病变是浆液性--纤维蛋白性多发性浆膜炎和多发性关节炎。近年来，还从细菌性肺炎、化脓性支气管肺炎病变中分离到副猪嗜血杆菌，而且通常将此菌看作是继发性病原菌。在猪繁殖与呼吸综合征、II型猪圆环病毒所致疾病(断奶猪多系统衰竭综合征)、伪狂犬病及猪流感等感染之后，这类菌分离的频率，甚至从浆液性--纤维蛋白性多发性浆膜炎病例中的分离频率一直都在增高。按Kieletein-Rapp-Gabrielson(KRG)血清分型方法，目前副猪嗜血杆菌至少可分为 15 个血清型[7]，其中在德国 4、5 型最为流行[7]，在澳大利亚 5 型、13 型最为流行[8]，在美国5型最为流行[9]。同时，20%以上的分离株不能分型[10]。在我国，副猪嗜血杆菌在各猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，已从北京、山东、黑龙江、辽宁、河南、湖南、宁夏、湖北等省市分离出副猪嗜血杆菌。

除了KRG血清分型方法之外，研究者也尝试用整个细菌体裂解产物进行SDS- PAGE 电泳，对副猪嗜血杆菌进行分型，结果除KRG血清型1型为SDS -PAGE III型外，其它血清型，如5型、6型、10型均属SDS- PAGE I型。HPS只感染猪，可以影响从2周龄到4月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病通常见于5～8周龄，发病率可达40%，严重时死亡率可达50%。通常可从健康猪的鼻腔分泌液中分离出病菌，还可以从患肺炎猪的肺脏中分离出来。在分离的15 种血清型菌株中，1、5、10、12、13、14型毒力最强，患猪归于死亡或处于濒死状态；2、4、8、15型为中等毒力，患猪死亡率低，但出现败血症状，生长迟滞；3、6、7、9和11型毒力较低，患猪没有明显的临床症状。

3 致病机理

呼吸道中的HPS可引起上呼吸道黏膜表面纤毛活动显著降低，损伤纤毛上皮，引起脓性鼻炎；病灶处由于纤毛丢失，鼻黏膜和支气管黏膜急性肿胀，黏膜损伤，从而增加细菌入侵机会。有研究表明，猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等能降低猪肺泡巨噬细胞的吞噬和杀菌能力，从而增加了Hps的感染机率。Hps的一种可溶性毒素可能与所观察到的细胞病变有关[10]。Lichtensteiger等的研究表明，90%以上的现场分离菌株都产生神经氨酸苷酶(唾液酸酶)，这种酶与透酶和醛缩酶协同作用，通过夺取宿主细胞的碳水化合物而增强细菌毒力。除了对营养方面的影响以外，神经氨酸苷酶还介导清除与宿主细胞糖原结合的唾液酸，从而暴露出细菌定居或侵入宿主细胞所需的受体，并通过降低黏蛋白的黏性从而干扰宿主的防御系统[5]。

另外，很多学者们认为，Glasser 病流行病学的改变在一定程度上是因为副猪嗜血杆菌在幼猪体内的定居模式所致，而这些定居模式则受到管理方法(比如隔离或早期断奶)的影响。这些观点可以归纳为：（1）仔猪可在不同时间被母猪排出的Hps所定居，定居时间取决于母猪的免疫力水平和母猪的细菌排出水平；（2）在一定的日龄，断奶猪中只有一定比例的个体被Hps定居，这一比例可随断奶日龄的增大而增加；（3）断奶时被Hps定居仔猪的比例较低时，则在保育舍内细菌从定居仔猪向非定居仔猪的传播会很慢；（4）在母源免疫力消失后受到感染的仔猪会发病。

4 分离与鉴定

在一般条件下，HPS难于分离和培养，尤其是应用抗生素治疗过的病猪病料，给本病的诊断带来了许多困难。因此，对于许多兽医来说，从临床样品中分离HPS仍是一个挑战。虽然用PCR可以检出临床样品中的HPS，但是，要通过血清分型与基因分型对分离物进一步定性，还必须进行分离。许多因素都可能会影响到HPS的分离，包括选择采样的动物和在样品提交给诊断实验室之前对样品的处理。研究表明，采取以下措施可以提高从临床样品中分离HPS的机会。

4.1 采样动物的选择 很少能从死猪中分离出HPS。为了提高分离的机会，应当对表现急性感染临床症状的未治疗猪进行无痛处死并采样。虽然最好选择表现有呼吸窘迫(腹式呼吸、咳嗽)和关节肿胀的猪采样，但是，对表现有中枢神经系统症状的猪也可以考虑，重要的是要从慢性病变中区分急性病变。在保育期暴发中存活的猪可能在肥育初期发生临床症状。这些临床症状可能与胸，腹腔发生纤维化有关。一般不能从慢性感染猪分离出HPS。

4.2 采样部位的选择 HPS是上呼吸道中一种共栖微生物。由于可以从健康动物的鼻腔、扁桃体、气管中分离出HPS。因此，分离HPS的理想部位是脑(脑膜)、心包、胸膜、腹膜和关节。在观察到纤维蛋白性胸膜炎时可以提交肺组织。在某些情况下，HPS只引起肺炎。从肺炎肺回收到分离物可能表示或不能表示侵袭猪群的“问题”菌株。虽然HPS可以引起败血症，并且可以表明在血液中发生急性感染，但是，并不常使用从现场病例采集的血液样品进行分离。

4.3 采样方法的选择 可以用无菌拭子采集供分离HPS用的样品，并将拭子置于含有Stuart或Amies培养基的运送系统中呈送。Amies系统保持HPS的活力比Stuart系统更好。应当用拭子采集器官表面上的纤维蛋白渗出物样品。免疫组织化学研究表明，在纤维蛋白渗出物中通常含有丰富的HPS细胞。可以用无菌注射器采集关节、腹膜、心包以及胸腔中的液体。HPS在组织中比在拭子中存活时间长。由于在同一头猪的不同部位可能分离出不同的HPS株，所以提供的组织样品应当单独包装呈送。可以从活动物采样而无须进行无痛处死。例如可以用无菌注射器和针头从肿胀关节采集滑液。采样后样品应当立即冷冻。

4.4 供分离用样品的呈送 HPS对温度敏感。在42℃下的生理盐水中1h、37℃下2h及25℃下8h HPS即不能检出。但在冷藏温度(4℃)下，HPS可以存活较长时间。采集供分离HPS的样品应当尽可能快的呈送诊断实验室(1～2d)。拭子、组织样品或含有体液的注射器应当用冰镇容器呈送。组织应当新鲜呈送，不要使用福尔马林保存。

5 诊断和防制措施

首先，可以根据临床症状进行初步诊断。其临床症状为：猪病早期病象包括被毛粗乱、精神沉郁、发热(40.5~42.0℃)、厌食，也可见到呼吸困难、关节肿胀、运动不协调、皮肤紫斑。病猪经常起卧，长声尖叫，颤抖，共济失调，可视黏膜发绀，跛行。一个或几个关节肿胀、发热和疼痛，多见于腕关节和跗关节。许多病例出现脑膜炎症状。耐过急性发病的猪可以痊愈，但受害严重者会留下后遗症，即母猪流产，公猪慢性跛行。

确诊必须进行实验室检查。由于在死亡病例较难分离到HPS，一般应选取典型病例人工处死。同时应注意的是，仅从鼻腔、扁桃体或气管等组织脏器中分离细菌，对于评估是否由HPS引起的致病是没有意义的，应从全身多个部位如心包、关节、心血、脑脊液等处进行病原分离。目前，用于HPS诊断的血清学方法有：琼脂扩散试验、补体结合试验、间接血凝试验等[2]。由于在一个猪群中，出现HPS的几种菌株或几种血清型毒株同时感染的现象比较普遍，甚至在个别病例，不同标本内可发现不同菌株或血清型感染，各血清HPS之间存在交叉反应，因此诊断意义不大。国内和国际上现都已开发出HPS的PCR诊断方法，可用于HPS的快速诊断，具有很高的灵敏度。

事实证明，副猪嗜血杆菌病的防治治仅使用抗生素来预防和治疗，效果往往得不偿失，要彻底解决猪场的副猪嗜血杆菌病问题，还必须依靠有效的疫苗。接种疫苗是控制HPS病的有效方法之一。如果将在猪群中引起发病的 HPS菌株应用在菌苗之中(商品苗或自家苗)，则可能成功地产生保护。让猪接触无致病力的 HPS菌株，也可诱发其对有毒菌株的抵抗力。已有报道能成功地使用商业化或自家菌苗预防和治疗本病，但也有一些菌苗缺乏效力的事例，这可能是因为病程中出现菌株的血清型不同而缺乏交叉保护力。由于菌株致病力的差异，以及当前对保护性抗原和毒性因子缺乏深刻的认识，还不可能有一种灭活疫苗同时对猪所有的致病菌株产生交叉免疫力。因此，在应用疫苗免疫的基础上，应加强对感染猪群中所有猪的抗生素治疗。同时，对HPS继发感染性疾病，要加强对原发病的控制和治疗，加大养猪场生物安全管理，减少或消除其它呼吸道病原物。此外，Takahashi 等通过临床和实验室研究表明，HPS血清2型和5型制备的二价疫苗比单价疫苗更能有效地保护猪群，可防止HPS病的暴发，二次免疫后保护期可达79d，这进一步证明各血清型间交叉保护力低，多价苗的免疫效果比单价苗的更好。因此，多价苗的研制将是 HPS疫苗今后的一个发展方向。

防治方案包括抗生素治疗和免疫接种，同时还要配合以优良的管理措施，以减少或消除其它呼吸道病原。加强饲养管理，减少各种环境应激，增强猪的抵抗力，加强隔离消毒，实行统一日龄断奶以及严格的全进全出制，杜绝将各生产阶段的猪或不同来源的猪混群饲养等。

[1] 华升, 梅书棋, 曾德芳等. 副猪嗜血杆菌病研究进展[J]. 动物医学进展, 2006, 27(11): 7-10.

[2] 斯特劳. 刘文军, 张中秋等译. 猪病学(第8版)[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 1998.

[3] Ruiz A, Oliveira S, Torremorell M, et al. Outer membrane proteins and DNA profiles in strains of Haemophilus parasuis recovered from systemic and respiratory sites[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(5): 1757-1762.

[4] Charland N, D'Silva CG, Dumont RA, et al. Contact-dependent acquisition of transferrin-bound iron by two strains of Haemophilus parasuis[J]. Can J Microbiol, 1995, 41(1): 70-74.

[5] Lichtensteiger CA, Vimr ER. Purification and renaturation of membrane neuraminidase from Haemophilus parasuis[J]. Vet Microbiol, 2003, 93(1): 79-87.

[6] Morozumi T, Hiramune T, Kobayashi K. Glasser’s disease in piglets produced by intraperitoneal inoculation with Haemophilus parasuis[J]. Natl Inst Anim Health Q, 1981, 21 (3): 121-128.

[7] Kielstein P, Rapp- Gabrielson VJ. Designation of serovars of Haemophilus parasuison the basis of immunodiffusion using heat- stable antigen extracts[J] .J Clin M icrobiol, 1992, 30(4) : 862-865.

[8] Rafiee M, Blackall PJ. Establishment, validation and use of the kielstein Rapp Gabrielson serotyping scheme for Haemoghilus parasuis[J]. Aust Vet J, 2000, 78 (3): 172-174.

[9] Rapp-Gabrielson VJ, GabrielsonDA. Prevalence of Haemophilus parasuis serovars among isolates from swine[J].Am J Vet Res, 1992, 53(5): 659-654.

[10] 翟晓兰, 陈小玲. 副猪嗜血杆菌病[J], 动物医学进展, 2006, 27(3): 99-101.

（2012–06–15）

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1007-1733(2012)09-0090-03