麻鸭源性鲍氏不动杆菌的分离与鉴定

吴 白 刘丹丹 陈 玉 王彦红 刘文博 （扬州大学动物医院 江苏 扬州 225009）

鲍氏不动杆菌是一种不发酵糖类、氧化酶阴性、硝酸盐还原阴性、不能运动的革兰氏阴性杆菌，是人类和动物皮肤、呼吸道和胃肠道常见的条件致病菌[1]。随着抗菌药物的不合理使用，细菌对抗生素的耐药性尤其是多重药物耐药性严重地危及着抗感染疾病的治疗[2,3]。本试验从麻鸭的肝脏内分离到一株革兰氏阴性短杆菌并进行了药敏试验。

1 材料与方法

1.1 发病情况 2011年8月扬州高邮某农户，带来3只50日龄麻鸭到扬州大学动物医院就诊，共饲养100只，已死亡20只。麻鸭病程3d左右，于35日龄时注射H5N2禽流感病毒疫苗。病死麻鸭剖检发现：肝、气囊、心表面有纤维性渗出物附着；肝脂肪变性；脾纹理明显肿大；心肌刷状坏死、出血；肠道有较多环状坏死。

1.2 细菌分离 取麻鸭的肝组织在无菌环境下接种于LB琼脂平板上，经37℃24h培养后，观察结果。在LB琼脂平板和麦康凯培养基上继续纯培养，观察LB琼脂平板和麦康凯培养基上细菌的生长状况。挑取单个致病菌落进行革兰氏染色，然后镜检。

1.3 生化试验 利用细菌微量生化反应管对所分离菌株进行生化指标测定[4］。37℃培养24h后观察结果。

1.4 药敏试验 采用纸片琼脂扩散法，药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司，操作方法和判定标准参照该公司操作方法与标准。药敏纸片有：痢特灵300μg/片，丁胺卡那霉素30μg/片，罗美沙星10μg/片，强力霉素30μg/片，氯霉素30μg/片，左氟沙星5μg/片，庆大霉素10μg/片，卡那霉素30μg/片，氟哌酸10μg/片，萘啶酸30μg/片，菌必治30μg/片，链霉素10μg/片，复方新诺明1.25/23.75μg/片，多粘菌素B300U/片，美洛西林75μg/片。

1.5 小鼠致死实验 待检菌株用LB平板37℃培养24h，在 平板中注入无菌生理盐水，吸取稀释液腹腔接种6周龄ICR小鼠2只，一只0.15ml，另一只0.2ml，观察24～72h，同时对死亡小鼠分离菌株。

1.6 16S rDNA基因测序法 将分离菌采用煮沸裂解法制备细菌基因组DNA模板，按照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(宝生物工程(大连)有限公司)方法操作，PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，用Agarose Gel DNA Extraction Kit(Roche公司)回收，回收产物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序；将测定的序列在NCBI网站进行BLAST搜索比对，鉴定细菌种属。

2 结果

2.1 细菌镜检 在LB琼脂平板上形成淡黄色圆形菌落，在麦康凯培养基上生长，菌落呈淡粉红色。革兰氏染色的镜检结果为革兰氏阴性短杆菌，散在出现，两端钝圆。

2.2 生化试验结果 细菌在37℃培养24h后，生化试验结果显示分离菌株不能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类，氧化酶阴性、硝酸盐还原阴性，生化结果符合鲍氏不动杆菌的特点。

2.3 药敏结果 药敏试验参照药敏试验判断标准，结果显示高度敏感的药物有丁胺卡那霉素、卡那霉素、庆大霉素；对痢特灵、左氟沙星、氯霉素、罗美沙星中度敏感；对强力霉素、氟哌酸、萘啶酸、菌必治、链霉素、复方新诺明、多粘菌素B、美洛西林等耐药。

2.4 小鼠致死效果 细菌稀释液腹腔接种2只6周龄ICR小鼠24h后都死亡，在无菌环境下对死亡老鼠的肝脏做触片进行美蓝染色。注入0.15ml细菌稀释液的老鼠肝脏边缘变黑，在显微镜下可见杆状细菌散在或成对出现。另一只注射0.2ml的老鼠肝脏已大部分变黑，做触片美蓝染色后亦可见较多的杆状细菌。

2.5 基因测序结果 通过因特网在NCBI 的Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中对分离菌株测序结果进行检索。结果显示此细菌是鲍氏不动杆菌。

3 讨论

（1）从病死鸭分离到一株细菌，因为此细菌的形态结构、生化特性等较少见，应用16S rDNA基因测序法快速鉴定分离菌显示为鲍氏不动杆菌，确定分离菌后对照其细菌培养、生化特性等亦符合鲍氏不动杆菌的生物学特性。由于细菌菌株的16S rRNA基因分子结构上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量信息，使16S rRNA基因成为了公认的细菌分类指标[5]，因而将测定细菌的16S rRNA 基因进行序列分析，运用于细菌的鉴定。16S rDNA序列分析是目前较好的快速而直接的检测微生物的分子生物技术的方法之一，已经被广泛使用[6]。（2）鲍氏不动杆菌广泛分布于自然界、存在于土壤、饮水、污水及食品中。鲍氏不动杆菌是不动杆菌在临床感染病例中出现率最高的，感染区域多在医院，最主要的是由于呼吸道感染[1]。鲍氏不动杆菌在人感染上已有较多报导[7,8]，在动物上的较少。鲍氏不动杆菌在环境中大量存在，抵抗力较强，并且对抗生素有广泛的抗性，在水中繁殖被麻鸭摄入体内造成麻鸭感染。鉴于药物在集约化养殖中使用日益广泛，鲍氏不动杆菌对动物致病的机会也日益增多，应予重视[9]。（3）鲍氏不动杆菌极易产生耐药性，药敏试验结果显示本次分离菌株对丁胺卡那霉素、卡那霉素、庆大霉素敏感，对多数抗菌素是耐药的，如对菌必治，美洛西林等头孢菌素类药物耐药，与许慧等报道结果相符[10]。因此需加强养殖户对预防鲍氏不动杆菌感染的知识，同时对养殖户进行滥用抗生素带来的危害等知识普及，使抗生素的使用更加合理化、科学化。针对药敏试验结果可选用其中一种敏感药物拌饲投喂，并定期对麻鸭生活的水环境进行消毒，改善水质以减少病原菌。

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