铁皮石斛的组培及污染处理技术

铁皮石斛为兰科多年生附生草本植物。生长于海拔达1600m的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数10种，铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛具有独特的药用价值，民间称其为“救命仙草”。

铁皮石斛生长于悬崖峭壁之阴处，由于它生长条件十分苛刻，自然产量极为稀少，更因民间长期过度采挖，致使野生资源濒临灭绝。而组培技术的出现解决了这一难题，通过现代科学技术成功地将只能在野外生长的铁皮石斛驯化进行人工种植，而通过组培技术可以获得更多的铁皮石斛种苗。

一、培养基的制作及接种

1.制作培养基 在制作培养基时（MS培养基），秤取药品的误差必须在一定范围内，并要在培养基中加入活性炭。

2.接种 在更衣室将工作服换上，戴上口罩。进入接种室之前用95%的酒精将裸露在外面的部分灭菌。进入接种室后用清洁布将台面擦拭干净，在台面上空喷75%酒精进行消毒，将灭菌盘放在台上待用。待灭菌器温度达到250℃时开始操作，将母苗在灭菌盘中用镊子分好待用,拿一培养瓶打开瓶盖,将灭菌器中的镊子取出在培养基中冷却，再用镊子将灭菌盘中的母苗插入培养基中，每瓶可插入25～28个生长点。分苗时要将苗上的培养基和黄、老叶捡干净，愈伤组织丢弃不要；在插苗时注意不能将大小苗混插，生长点数要插够，以保证苗的质量。丛生芽单独插1瓶。

二、培养及炼苗

在接种完成后将种苗放入组培室的架上，将组培室的灯开启，提供足够的光照（光照时间为12小时/天，光照强度为 2000lx）和温度（25±2℃），湿度保持在70%～80%，以便种苗能够正常生长。在组培室培养一段时间后，将种苗转入大棚中进行炼苗，让种苗长的更健壮，根据天气情况适当地调节大棚中的温度。光照强度大于10000lx时需遮荫，一般采用70%遮荫能达到理想效果。在大棚中放置2天后，解开绑扎封口膜的皮筋，但不要揭开封口膜（如是胶塞封瓶的，则将胶塞启松，但不打开；如为密封的袋苗，则不需处理，直接放置），放置1周后出瓶。大约在大棚中培养3～5个月就能将种苗出售。

三、污染处理

在组织培养过程中，多种因素容易造成铁皮石斛组培苗的污染，如发现污染的组培苗应及时处理掉，以免大面积感染。铁皮石斛组培苗的污染主要有以下几种情况。

1.螨虫污染 螨虫属节肢动物门蛛形蜱螨亚纲的一类体型微小的动物，身体大小一般都在0.5mm左右，有些小到0.1mm，大多数种类小于1mm。螨虫污染主要与培养基中水分过多有关。

2.玻璃化苗 在组培过程中，组培苗叶片和嫩梢呈透明水渍状的现象，它是组培苗的一种生理失调症状。玻璃化大大降低了试管苗有效增殖系数，严重影响苗的质量。影响玻璃化苗产生的因素主要有生长调节剂、温度、湿度、光照时间等。

3.褐变 是苗在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质被氧化为棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散，致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响苗的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡。影响组培苗褐变的因素主要有苗中酚类物质的含量、外植体的大小、培养基的成分、激素类型等。

4.真菌污染 污染苗呈现黑色和灰色霉菌，在接种3~10天后极易发生。造成真菌污染的原因主要有周围环境不洁净、工作台的过滤装置失效、培养瓶口径过大等。

5.细菌污染 菌斑呈粘液状物，一般在接种1~2天后极易发生。造成细菌污染的原因主要有初母苗带菌或培养基灭菌不彻底，操作人员违规操作等。