凋亡素VP3蛋白的原核表达及纯化

邓守恒，柯贤柱，石小燕，蔡召忠，杨敬宁，黄永章，陈 萍

(1湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心，湖北十堰442000;2武汉市中心医院; 3湖北医药学院免疫教研室)

鸡贫血病毒(CAV)VP3基因是近年发现的凋亡诱导基因，可特异性地诱导人类多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无影响［1］，在肿瘤治疗中受到国内外研究者的关注。目前的研究多集中于VP3基因对肿瘤细胞的作用［2，3］，很少有VP3蛋白抗肿瘤作用的报道。2010～2011年，本研究采用靶向克隆法成功构建pET15b-VP3原核表达质粒，诱导表达并纯化VP3蛋白，为深入研究VP3蛋白的结构、功能、药理作用及临床应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 ①菌株、质粒和引物:PGEX-6P-1/TATVP3质粒(昆明医学院王剑松教授惠赠)，线性pET15b、大肠杆菌DH5a、E.coliRosetta(十堰市人民医院临床医学研究所提供)。PCR引物由上海生工公司合成。②试剂:限制性内切酶XhoⅠ、BamHⅠ(美国)，AdvantageR2 Polymerase Mix(大连)，DNA片段纯化试剂盒、200碱基对标准DNA(北京)。靶向克隆酶试剂盒(美国Loopile公司)，Ni2+-氮基三乙酸琼脂糖亲和层析柱(美国Bio公司)，Western blotting检测试剂盒(KPL公司)。③主要仪器:PCR仪(德国)，凝胶图像分析系仪(天呈科技公司)，凝胶电泳仪(大连)，核酸蛋白检测仪(上海)。

1.2 方法

1.2.1 pET15b-VP3重组质粒构建 以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板，利用引物进行PCR扩增。扩增条件:起始变性95℃1 min;然后95℃30 s、68℃3 min，35个循环;最后68℃延伸3 min。PCR产物电泳鉴定，低熔点琼脂糖凝胶电泳并回收纯化366 bp的VP3 cDNA片段，运用靶向克隆酶，将纯化后的VP3 cDNA与末端序列相同的线性pET15b进行同源重组，将连接产物转化至大肠杆菌DH5a，并涂布到含氨苄青霉素(100 μg/mL)的TB培养基上16 h，选单个菌落接种于含氨苄青霉素(100 μg/ mL)的TB培养基上培养24 h，少量提取质粒，通过XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定;然后将pET15b-VP3重组质粒送上海生工公司测序鉴定。

1.2.2 VP3蛋白表达 将pET15b-VP3重组质粒分别转化 E.coliRosetta，铺在含氨苄青霉素(100 μg/mL)的TB培养基上16 h，挑取单个菌落至200 mL含氨苄青霉素(100 μg/mL)的TB培养基中37℃放大培养，当细菌生长至A600为0.5～1.0时，加入0.83 mol/L IPTG至终浓度0.83 mol/L，置25℃诱导培养12 h。

1.2.3 VP3蛋白纯化 将上述菌液在4℃、5 000 r/min离心4 min后，弃上清收集菌体，用PBS洗涤3次，将菌体溶于50 mL缓冲液 A(1×PBS，20 mmol/L咪唑，6 mol/L尿素，pH 8)中，400 W、10 min、间隔5 min，4℃超声破菌41 min。将破菌完全的较澄清菌液置于超速冷冻离心机中，20 000 r/ min、4℃离心10 min后，收集上清液;将上清液缓慢加入Ni2+-氮基三乙酸琼脂糖亲和层析柱，上样完毕后，杂交结合3 h，用10倍体积的缓冲液A过柱，洗去未结合的杂蛋白;最后用洗脱缓冲液B(1×PBS，500 mmol/L咪唑，6 mol/L尿素，pH 7.5)将VP3蛋白洗脱下来。

1.2.4 VP3蛋白的SDS-PAGE、Western blotting鉴定 收集洗脱峰值的洗脱液行12%SDS-PAGE，将电泳后凝胶置于考马斯亮蓝R-250液中染色，拍照后100 mA转膜2 h，在膜上加入兔抗多聚组氨酸抗体(1∶1 000)于室温下孵育过夜;加入山羊抗兔抗体(1∶10 000)于室温下孵育2 h，用ECL显影。将含有VP3蛋白的洗脱液依次置于4 mol/L尿素12 h、2 mol/L尿素12 h、3次1×PBS各24 h中4℃透析脱盐，用直径0.22 μm的一次性滤器过滤透析后的蛋白，以牛血清白蛋白做对照，用Bradford法测定VP3蛋白浓度。

2 结果

2.1 VP3基因 PCR扩增结果 以 PGEX-6P-1/ TAT-VP3质粒为模板，用VP3上、下游引物行PCR扩增，将PCR扩增产物行1.2%普通琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下可见扩增出366 bp的特异性VP3片段。

2.2 pET15b-VP3原核表达质粒构建、酶切和测序鉴定结果 XhoⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定显示，在靶向克隆酶作用下，阳性克隆中含有长度约5 700 bp的pET15b和366 bp的VP3条带;测序结果表明，VP3cDNA序列成功克隆入了pET15b，且其序列与GeneBank中的 VP3 CDNA序列完全一致，证明pET15b-VP3原核表达质粒构建成功。

2.3 VP3蛋白在大肠菌中的表达、纯化与鉴定 丽春红染色后发现，参照标准分子量蛋白，可见有13.6 kD的VP3目标条带，Western blotting分析表明此目标条带即VP3蛋白;Bradford法测得VP3蛋白的产量约为9.53 mg/100 mL菌液。

3 讨论

CAV属圆环病毒科圆环病毒属，其基因组全长约2.3 kb，组成环状负链DNA，有3个部分或完全重叠的开放阅读框，分别编码VP1(51.6 kD)、VP2 (24.0 kD)、VP3(13.6 kD)3种蛋白［4，5］。VP3和VP2的开放阅读框相互重叠，其编码基因全长366 bp，在各病毒株之间同源性较高。有研究表明，VP3可通过独立于p53的作用途径、不被Bcl-2抑制的方式选择性地诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无毒性作用，因而VP3基因被称为肿瘤特异性凋亡基因，其表达的 VP3蛋白称为凋亡素［6，7］。

本研究采用基因工程手段制备VP3蛋白，解决了正确构建pET15b-VP3重组质粒、使pET15b-VP3重组质粒在宿主菌中表达的目的蛋白能进行有效地分离和纯化的两个关键问题。第一，本研究采用最新的靶向克隆法进行构建，在PCR上、下游引物中分别加上XhoⅠ、BamHⅠ酶切位点，还设计了部分与线性化载体pET15b切口两端同源的序列，以使目的基因扩增产物经双酶切后能与载体进行靶向同源重组;并在PCR反应中用AdvantageR2 Polymerase Mix，其保真度是标准TaqDNA聚合酶的3倍以上，可有效地降低PCR反应中的错配率，获得较高的产量。获得的阳性克隆经酶切和测序鉴定后证实，pET15b-VP3重组质粒构建成功，VP3 cDNA编码区成功地克隆入了pET15b。第二，本研究选用的运载体是pET15b，其作为运载体所表达的基因工程重组蛋白在其N端带有一个由6个组氨酸组成的“标签”，可在Ni2+-NTA-树脂柱进行亲合层析吸附，方便后期对表达蛋白进行分离和纯化［8］。纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting检测，显示出特异性的VP3蛋白条带，且其蛋白相对分子量为13.6 kD，表明凋亡素VP3蛋白表达及分离纯化成功。

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