miR-214在肾上腺皮质肿瘤组织中的表达及意义

杨明妍，罗佐杰，邝晓聪，秦映芬，梁杏欢，冼 晶

(1广西医科大学第一附属医院，南宁530021;2广西医科大学病理生理教研室)

微小RNA(miRNA)是一种长约22 nt的非编码小分子RNA，主要通过降解靶mRNA或抑制mRNA翻译而调节相关蛋白表达［1］，其调节方式在许多生理、病理过程中起重要作用。近年研究表明，miRNA可能参与人类癌症的发生，有的miRNA可能有原癌基因或抑癌基因的作用，miR-214即为其中的一种［2～6］。miR-214是新近发现的miRNA，目前，关于miR-214对肾上腺皮质癌调控机制的研究少见报道。为探讨miR-214在肾上腺皮质肿瘤发生、发展中的作用，我们观察了miR-214在肾上腺皮质腺瘤组织、瘤旁正常组织、人肾上腺皮质癌SW-13细胞系(SW-13细胞系)和裸鼠皮下移植瘤组织中的表达情况。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年12月～2011年6月在广西医科大学第一附属医院施行肾上腺皮质肿瘤手术患者21例，男8例、女13例，年龄23～56 (40.7±10.4)岁。选取其术后肾上腺皮质切除组织，离体后迅速置于液氮中冷冻，－80℃保存。其中肾上腺皮质癌组织5份、肾上腺皮质腺瘤组织8份、肾上腺皮质腺瘤瘤旁正常组织(瘤旁正常组织) 8份，均经病理检查证实。另选本课题组前期研究保存的SW-13细胞系裸鼠皮下移植瘤组织6份，其造模和取材方法见文献［7］。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肾上腺皮质癌SW-13细胞系购自上海中国科学院细胞库，采用含10%胎牛血清的DMEM/F12以1∶1比例作为培养基，将人肾上腺皮质癌SW-13细胞放置在37℃、5%CO2条件下培养。细胞生长至80%融合时，用2.5%胰酶消化并进行传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 miRNA提取 采用天根生化科技公司产miRcute miRNA提取分离试剂盒提取总miRNA;最终获得的miRNA溶于无RNase水，－80℃保存。用紫外分光光度计检测样品纯度，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定样品完整性。

1.2.3 RT-PCR检测 采用天根生化科技公司产miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒对总miRNA进行逆转录，将最终获得的cDNA置入－20℃保存，并以此为模板进行 PCR扩增。根据 Gene Bank的基因序列设计miR-214引物，进行RT-PCR检测。应用Primer 5.0软件，并取U6作为内参。目的基因miR-214上游引物为5'-TGCGGACAGCAGGCACAGAC-3'，下游引物为5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3';内参 U6上游引物为5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'，下游引物为5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。上述引物均由上海生工合成，－20℃保存。PCR反应条件:94℃预变性4 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，共40个循环。实验重复3次，结果用ABI7500统计软件进行分析。将PCR扩增产物回收、纯化后进行测序及鉴定。RT-PCR结果以 Ct值表示，采用2－△△Ct法比较miR-214的表达差异，以瘤旁正常组织为对照，U6为内参，计算待测样品的△△Ct值，△△Ct=(待测组目的基因平均Ct值－待测组内参基因平均Ct值)－(对照组目的基因平均Ct值－对照组内参基因平均Ct值)。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，实验结果用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总miRNA样品的鉴定 提取各组织标本总miRNA，经紫外分光光度计检测显示，其 OD260/ OD280值为1.8～2.1，说明样品纯度高、无污染;经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测显示，各组织标本总miRNA有3条清晰的RNA带，分别为28、18、5 s，说明样品无降解、质量好。

2.2 PCR产物的特异性 荧光定量PCR熔解曲线显示，PCR反应为单一峰，无非特异性荧光，提示PCR扩增产物特异性好。测序结果显示，目的基因扩增产物为miR-214片段。本实验中miRNA-214起始模板扩增循环数为23.18±2.18，说明PCR检测灵敏度高;PCR扩增曲线显示，各反应已经到达平台期，提示PCR扩增效率好。

2.3 miR-214表达 2-△△Ct法分析显示，miR-214在瘤旁正常组织、肾上腺皮质腺瘤组织、肾上腺皮质癌组织、SW-13细胞系、裸鼠皮下移植瘤组织中的表达分别为4.993±0.673、5.118±0.723、6.313± 0.446、6.432±0.320、7.931±0.742。miR-214在肾上腺皮质腺瘤组织、肾上腺皮质癌组织、SW-13细胞系、裸鼠皮下移植瘤组织中的表达水平分别是瘤旁正常组织的0.917、0.400、0.369、0.131倍。与肾上腺皮质腺瘤组织和瘤旁正常组织比较，肾上腺皮质癌组织、SW-13细胞系、裸鼠皮下移植瘤组织中的miR-214表达明显降低(P均＜0.01);与肾上腺皮质癌组织和SW-13细胞系比较，裸鼠皮下移植瘤组织中的miR-214表达降低(P＜0.05)。

3 讨论

miRNA是一种能调控蛋白质编码基因的非编码RNA，广泛存在于真核生物中，其在细胞核内转录成前体转录本，由RnaseⅢ核酸酶Drosha加工成发夹状pre-miRNA转运到细胞质，由RnaseⅢ核酸酶Dicer加工为成熟的miRNA，通过与靶基因的3'非翻译区互补配对，在转录后水平调节靶基因表达;主要参与调控细胞生长、干细胞分化和肿瘤发生与发展等重要的生物学过程［1，8］。

miR-214是新发现的miRNA，可通过不同的靶基因、蛋白和通道发挥作用，调节细胞生长、分化、耐药和血管生成;在不同肿瘤的生长过程中，其既可能作为癌基因存在，又可能作为抑癌基因发挥作用［3～6］。Yang等［3，4］研究表明，miR-214能靶向抑制人类卵巢癌的抑癌基因PTEN表达，启动PI3K/ Akt通道，导致癌细胞凋亡减少，使其对顺铂的耐药性增加;认为miR-214起癌基因的作用。Peter等［5］研究表明，增加T细胞中的miR-214表达，可通过其对PTEN的靶向作用提高T细胞的增殖率。Yang等［6］研究发现，与正常宫颈组织比较，miR-214在宫颈癌组织中的表达下调;并发现在人宫颈癌HELA细胞中对miR-214进行过表达处理后，其细胞增殖率明显降低，与miR-214对人卵巢癌细胞和T细胞增殖、凋亡的调控作用恰恰相反［3～5］。因此，Yang等［6］推测miR-214在宫颈癌的发生、发展中起抑癌基因的作用，并用基因芯片筛选出MEK3和JNK1为其靶基因。

肾上腺皮质癌是一种发病率低、恶性程度高的内分泌肿瘤，该病的临床症状和病理变化缺乏特异性，其与良性肾上腺皮质肿瘤的主要区别是可转移、复发。因此，寻找调控肾上腺皮质癌恶性行为的相关基因是目前研究的重点。本研究显示，与肾上腺皮质腺瘤组织、瘤旁正常组织比较，肾上腺皮质癌组织、SW-13细胞系、裸鼠皮下移植瘤组织中的miR-214表达明显降低;提示miR-214表达下调可能参与肾上腺皮质癌的发生、发展。

许多研究证实，肿瘤微环境可影响肿瘤细胞的生长、侵袭和转移［9，10］。因临床难以获得大量的肾上腺皮质癌标本，故为其研究带来一定困难。裸鼠皮下移植瘤模型是一种经典、实用的动物模型，本研究显示，与肾上腺皮质癌组织和SW-13细胞系比较，裸鼠皮下移植瘤组织中的miR-214表达降低，其表达差异可能与裸鼠皮下微环境有关。

综上所述，miR-214表达下调可能参与肾上腺皮质癌的发生、发展。但对miR-214有无调控肾上腺皮质癌细胞的增殖、凋亡等生物学特性，miR-214在肾上腺皮质癌生长过程中充当癌基因还是抑癌基因的作用及其机制，尚有待于进一步研究。

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