国内抗草甘膦转基因棉花及相关抗性基因研究概述

2012-04-13马燕斌梁爱华马冬菊李燕娥

山西农业科学 2012年7期

王霞，马燕斌，吴霞，梁爱华，马冬菊，王华，李燕娥

（1.运城学院生命科学系，山西运城044000；2.山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000；3.山西大学生物技术研究所，山西太原030006）

草甘膦是一种广谱性灭杀除草剂。由于其具有在土壤中极易降解和对环境几乎不造成为害等优点，已经得到大面积推广使用[1]。但是在农田中使用草甘膦灭杀杂草的同时，往往也会对作物造成损害。

为此，研究培育具有抗或耐草甘膦除草剂的作物新品种成为育种的重点目标。棉花是我国重要的经济作物，其中，国内以山西省农业科学院棉花研究所为代表的转基因抗虫棉的成功研制，极大地促进了我国棉花的生产发展，也为以后我国新的转基因棉花选育改良等研究奠定了坚实的基础[2-4]。

结合现阶段棉花生产的实际发展需求，笔者对我国在抗草甘膦除草剂棉花的研究应用等相关内容进行了概括探讨。

1 草甘膦除草剂与棉花的抗草甘膦对策

植物能够通过茎叶吸收草甘膦，而草甘膦是通过抑制植物体内芳香族氨基酸合成途径中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS酶）的活性，阻断芳香族氨基酸的合成，从而杀灭杂草。由于草甘膦对所有植物的该代谢途径作用效果相同，所以，在草甘膦杀灭杂草时，对所有植物的作用机理相同。因此，除草剂的使用实现了对作物田内杂草的免除，同时也可降低劳动力的使用及提高生产效率，但由于作物本身对草甘膦不具有耐药性，因而，草甘膦的使用也会对作物产生药害。

针对这一状况和潜在的商业利益，各国科研工作者开始进行抗草甘膦育种的研究。我国科研人员也进行了积极的研究来防止其为害发生，并取得了一定的成果。解决方法除了通过在田间喷洒除草剂进行预防外，通过常规育种选育和基因工程等手段来获得抗除草剂的棉花等作物，也是解决这一问题的有效途径。具体的方法原理包括几点。

一是通过不同草甘膦浓度水平胁迫的方法选择育种。这一手段的目的是在一定浓度的草甘膦抑制前提下，植物体内仍有足够的EPSPS酶进行正常代谢，最终使选育出的作物耐草甘膦性提高。二是通过分子技术手段。其包括过量表达作物自身的EPSPS酶、对EPSPS酶本身进行突变修饰以及对EPSPS酶的代谢途径进行修饰，使作物的EPSPS酶降低或不受草甘膦抑制而保持正常的代谢。三是利用某些微生物的EPSPS酶。该方法与第2种方法类似，但由于亲缘关系较远，蛋白序列差异较大，因此，筛选到不受草甘膦抑制或受抑制作用较小的EPSPS酶的可能性较大。四是寻找能够分解代谢草甘膦的基因，将这一类基因转入目标植物后在细胞内形成一类防护机制，从而保护目标植物不受草甘膦药害。五是通过物理或化学等手段处理（包括体细胞诱变、辐照和化学诱变剂等）作物后获得抗性基因突变体植株。这一方法操作简单，筛选的基因型突变有可能更加广泛，但能够获得抗性植株的概率较小，且基因型突变鉴定的后期工作量较大。

2 抗草甘膦基因来源及相关分子生物学研究

研究表明，EPSPS酶和GAT基因编码的草甘膦N-乙酰转移酶能够对草甘膦抗性起到一定作用，其中，对EPSPS酶的研究较多，应用也较为广泛，而草甘膦N-乙酰转移酶及其GAT编码基因的研究相对较少。目前，通过生物工程手段利用的主要是抗草甘膦EPSPS合成酶，根据基因序列比对和抗体试验结果，该基因可分为EPSPSⅠ和EPSPSⅡ。这2类EPSPS基因的序列同源性仅为50%左右，抗体作用不发生交叉反应，且这2类编码基因来源广泛，包括各类植物和微生物。

刘柱等[5]从极端污染的土壤中分离到1株对草甘膦有极端抗性的细菌菌株HTG7。它能够在以草甘膦为选择压力的限制性培养基上生长，其最高耐受能力为500mmol/L。刘光全等[6]通过PCR突变技术获得了具有EPSPS酶功能而不具有草甘膦抗性的Pmu1和Pmu2突变株，并通过蛋白结构模拟和测序手段预测其突变位点对草甘膦抗性的重要性。

除通过对微生物的抗草甘膦特性进行筛选获得EPSPS基因外，在植物的EPSPS基因研究方面，尉万聪等[7]通过草甘膦处理诱导大豆和棉花的表达，克隆了相关的63个有差异的EST序列。程海刚等[8]对青麻EPSPS基因在酵母中表达认为，该基因具有生物学功能。周晓卉等[9]进行了薤白EPSPS合成酶基因cDNA的克隆与原核表达分析，认为薤白EPSPS对草甘膦具有一定的抗性。邓运涛等[10]对诸葛菜EPSPS基因5′端的克隆和序列进行了分析。童旭宏等[11]克隆获得了陆地棉的1个拷贝EPSPS基因，该基因编码序列长度为1 566 bp，其组织特异性表达具有一定的差异。

3 棉花及其他作物中EPSPS酶的研究

我国在抗草甘膦除草剂的转基因棉花等方面进行了较多研究。祝水金等[12]利用体细胞连续定向筛选技术，结合体细胞诱变技术获得了非转基因抗草甘膦棉花突变体株。陈旭升等[13]利用草甘膦筛选到1个抗草甘膦棉花种质系G-6，通过抗性遗传规律分析，认为抗性符合3∶1的分离规律，抗性受1对显性基因控制。谢龙旭等[14]利用农杆菌介导法把抗草甘膦基因aroAM12导入棉花中，并对其抗性进行了研究。刘锡娟等[15]把荧光假单胞菌种克隆的EPSPS基因转入烟草和棉花中获得抗草甘膦植株。赵福永等[16]成功地将抗草甘膦基因aroA-M1导入棉花中。此外，山西省农业科学院棉花研究所与浙江大学等国内单位合作，通过农杆菌介导的转基因方法培育新型的抗草甘膦与抗虫棉花也已经取得巨大进展。

同时，在玉米、水稻、大豆等作物中也有较多的研究报道。王秀君等[17]利用花粉管通道法把mG2-EPSPS基因导入玉米自交系中，并获得能耐受0.25%草甘膦药液的抗性植株。苏军等[18]利用Error-prone PCR获得的EPSPS酶突变基因转入水稻中，并进行了较详细的抗性和农艺性状的调查研究。王晓波等[19]对外源抗草甘膦EPSPS基因在大豆基因组中的整合与定位进行了研究，发现插入位点中NOS下游的大豆基因组序列发生重排，导致一个编码HEC1和HEAT的功能域基因结构受到影响。除此之外，邓力华等[20]利用EPSPS基因作为选择性筛选标记构建了抗虫表达载体，为其后续的转基因作物筛选利用提供了多样化。另外，卜贵军等[21]研究了对大豆喷施草甘膦后，草甘膦对大豆叶片超微结构及生化指标的影响。刘延等[22]对草甘膦喷施田旋花和打碗花后体内草莽酸含量进行了初步分析。

4 抗草甘膦转基因作物的生物安全性研究

目前，转基因对生物安全性的影响倍受关注，但相关研究的结论性结果较少。其中，徐广惠等[23]认为，转基因大豆在不同程度上降低了根际土壤细菌的数量和细菌群落的多样性，并对根际土壤中Nitrospira属细菌有一定的抑制作用。但抗除草剂转基因大豆对节肢动物群落多样性无明显影响[24]。而用含转基因豆粕的饲料饲喂大鼠时，在胃、肠道内容物中发现了转基因豆粕的内源基因和外源基因片段，但在其血液及各组织器官中则没有发现[25]。另外，自然条件下人为加大虫媒传播（大于10头/m2），抗草甘膦基因的花粉漂移概率接近0.05%，漂移距离为0.7 m[26]。此外，宋小玲等[27]以抗除草剂草甘膦和草丁膦转基因油菜为父本、诸葛菜为母本，在人工授粉条件下研究抗性基因向诸葛菜的潜在基因漂移，认为抗除草剂转基因油菜的抗性基因向诸葛菜漂移的可能性较小。

目前，关于植物转基因的安全性评价问题存在诸多争论。国内已有对转基因安全性的研究，但均属初步探讨，试验结果仍待探究。而毋庸置疑的是，转基因技术手段对植物基因功能的研究具有极大帮助。在作物基因利用方面，我国棉花抗虫性的成功对于棉花生产具有巨大促进作用，但转基因作物安全性仍将面临诸多争论与挑战。

5 抗草甘膦基因专利与转基因作物的商业化竞争

我国是草甘膦使用较多的国家，在与草甘膦相关抗性基因的研究方面虽然取得一定的进展，但与国外相比差距仍然较大。宋敏等[28]对抗草甘膦基因EPSPS的专利保护进行分析，结果表明，EPSPS的专利申请量迅速增加，且绝大部分专利由孟山都等跨国公司拥有；而我国目前申请的EPSPS基因专利相对较少。在抗草甘膦转基因棉花等作物的商业化方面，棉花、玉米、大豆、甜菜、马铃薯等多种抗草甘膦转基因作物在美国、阿根廷、加拿大、巴西等国被批准种植，中国也已批准棉花、玉米、大豆、油菜的种植，但目前并没有看到国内科研机构或公司等在上述作物育种审定方面的报道。另外，相比国外公司或单位所申请的抗草甘膦转基因作物种类种植许可可以看出，我国对抗草甘膦基因及其转基因棉花等作物研究起步相对较迟，但近年来研究非常活跃，这与生产实际需要以及潜在的商业价值密切相关；无论如何，抗草甘膦或其他转基因作物的研究已经成为目前作物遗传育种中重要的组成部分。

6 结语

到目前为止，世界上商业化的抗草甘膦棉花等作物的种植面积和种类在不断增加。基于转基因作物培育的竞争趋势，认为当前应积极筛选新的有利用价值的抗草甘膦基因，并详细阐明基因功能以及对其进行知识产权保护和开发利用，对我国培育具有竞争优势的棉花等作物品种将会具有明显的推动作用。目前，我国通过转基因生物新品种培育重大专项投入，极大地推动了我国在转基因作物领域的竞争发展，而转基因作物的研究发展将会更加广泛。鉴于此种发展趋势，科学地改进目前转基因的方法、严格界定转基因作物利用目的和种类、积极培养高素质科研人员以及规范转基因法律法规等对转基因安全性都能够起到一定的积极作用。此外，棉花生产在满足我国不同消费需求方面将会发挥重要作用，而安全利用转基因技术对促进我国棉花等作物的生产具有重要意义。

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