牛结核病诊断方法研究

夏辉 卢国伟 付刚 （山东省临朐县畜牧局 262600)



牛结核病诊断方法研究

夏辉 卢国伟 付刚 （山东省临朐县畜牧局 262600)

牛结核病主要是由牛分支杆菌引起的一种人畜共患传染病，近年来该病发病率有所上升，给奶牛养殖业造成了巨大的危害。目前，牛结核病的诊断仍然以传统的迟发性变态反应试验为主，其他诊断方法有根据临床症状和病理变化诊断、抗酸染色法、PCR 法、血清学等方法。为了净化该病，必须提高诊断方法的敏感性和特异性。为了探索基层兽医机构对该病的诊断方法的应用，文章对这些诊断方法及其优缺点做了分析，并指出结核病基层普查检测时，比较合理经济的诊断方式是迟发性变态反应试验和间接ELISA法同时运用。

1 牛结核病的基本情况

结核病是由分支杆菌属的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分支杆菌(M.bovis)和禽分支杆菌(M. avi um)引起的一种严重的人畜共患慢性消耗性传染病。除感染人外，能引起多种哺乳动物和禽类发病。结核分支杆菌、牛分支杆菌和禽分支杆菌，分别主要引起人结核、牛结核和禽结核。牛结核和人结核可以相互感染，禽结核也可以感染牛和人类。牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分支杆菌引起，能在多种组织器官形成干酪样坏死、肉芽肿(结核结节)和钙化结节病变为特征。在家畜中，牛最易感染结核病，特别是奶牛，其次是水牛和黄牛。世界动物卫生组织(OIE)将牛结核病列为B类动物疫病。

20世纪50年代我国出现了牛结核病的大暴发，如1955年检出阳性率达36.4%，以后由于采取了有效措施及长期努力，使结核病阳性率大大降低并控制在较低水平。1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结核病的患病率分别为5.83%和5.43%。但近年来，随着个体奶牛养殖户的增加，结核病的阳性检出率在逐年上升。尤其是2003年广州市某大型奶牛公司下属奶牛场630头奶牛有70%患结核病的情况下，每日仍有2t多病牛奶供应广州市场。目前我国一些省区牛结核病的发病率呈现上升趋势，已达到9%甚至更高的阳性检出率。因此，做好牛结核病的定期检测普查工作相当重要。笔者所在的临朐县是奶牛养殖大县，在基层兽医站利用合理经济的诊断方式诊断牛结核病对当地奶牛产业的发展作用更加明显。

2 临床症状和病理变化

牛结核病临床症状不典型，感染前期不出现临床症状，而感染后期常出现体弱、厌食、消瘦、呼吸困难、淋巴结肿大和咳嗽等，这些症状在其它疾病中也可见到，因此不具有典型性，故早期临床诊断不易获得准确结果。病理学检查可以根据特征病变确诊，如干酪样坏死、钙化、上皮样细胞、多核巨细胞和吞噬细胞等，但必须在宰杀后才能进行。

3 牛结核病的诊断方法

3.1 抗酸染色法 病料涂片后进行抗酸染色，显微镜检查抗酸性杆菌，本菌的细胞壁不仅有肽聚糖，还有特殊的糖脂，因为糖脂的影响，致使革兰氏染色不易着染，但能抵抗30ml/L酸酒精的脱色作用，抗酸染色为红色，常用齐尼二氏(Ziehl2Neel son)染色法，也可用荧光抗酸染色法。如果组织内有抗酸性微生物，并且具有典型的组织学病变，则可以做出初步诊断。抗酸染色法阳性率比较低，但它作为一种传统的检测方法，具有假阳性率低，价格低廉，操作简便等特点，在牛场中就可进行，所以仍有一定的实用价值。

3.2 PCR法 PCR技术自1983年发明以来，显示出了灵敏度高、特异性强、快速等特点，已经被广泛地用于检测疑似结核病病人的临床样品(主要是痰液)，近年来在检测牛结核病方面也有应用。Ritelli M等道，将人的一个巨噬细胞系用来从临床样品中分离扩增分支杆菌，收集培养后的细胞，再通过半套式PCR检测培养物中牛分支杆菌的特异性插入序列IS6110，可以确定有没有牛分支杆菌感染。刘思国等根据已经发表的牛分支杆菌的pncA基因序列，设计引物可扩增294bp目的片段，建立了特异性检测牛分支杆菌的PCR方法，该方法特异性强，敏感度可达到50pg，阳性样品符合率为90%，阴性样品符合率为100%而且有利于结果的判定和临床样品的直接检测。但是，商品化试剂盒和各科研部门研制的方法检测结果差异较大。含有少量细菌的样品降低了检测结果的可靠性。由于去除污染的方法、DNA提取步骤、去除酶抑制剂技术、内部和外部控制以及交叉污染的防止措施等差异使得结果千差万别。该方法还需要标准化和更加严格的操作步骤，以克服实验过程中容易出现的假阳性或假阴性问题。

3.3 迟发性变态反应试验 目前临床上应用最广泛的是迟发性变态反应(delayed type hypersensitivity，DTH)试验，即结核菌素试验(tuberculin test)，它是测定牛结核病的标准方法，也是国际贸易的指定方法。对牛皮内注射结核菌素，并在72h后测量注射部位肿胀程度。美国就是采用扑杀结核菌素试验阳性牛而消灭了牛结核病。它的技术要求不高，但是工作量大，检出时间长，操作麻烦，许多因素都可以降低该方法的敏感性和特异性。由于提纯结核菌素(PPD)皮肤试验个体差异较大，注射剂量和PPD批号对牛个体反应均有差异，会呈现不同的皮肤反应，其结果以皮肤厚度的增加数为准，易造成人为误差。结核菌素试验阳性仅能表明在过去某一时间曾经发生过的一次结核菌感染，它无法证明目前的结核菌感染是否为活动的，或仅为在机体的某处有活的结核菌存在。当动物发生某些细菌或病毒的感染时，或者使用某些药物治疗及一些不明原因，也可能造成假阳性或假阴性结果。部分研究者还发现，该法存在着极强的非特异性，即在相当数量的结核菌素试验阳性牛中，既找不出特征病变，又不能分离出结核菌，或仅仅分离出非典型的分支杆菌，重复检疫时阳性率下降，而且妊娠母牛检出率低，给基层的扑杀工作带来困难，因此在实际工作中，用于诊断牛结核病并不十分理想。

3.4 ELISA法 细胞免疫随病情加重而减弱，体液免疫随病情加重而增强。结核菌是典型的胞内寄生菌，尤其是在巨噬细胞内。对结核菌的免疫，首先是细胞免疫，其次才是体液免疫，二者是分离的。所以反映细胞免疫强弱的迟发性变态反应，不能检出所有的结核病牛，仅以此法检测牛结核病显然是不准确的。研究认为，结核病牛血清抗体IgG与正常水平差异显著，从理论上阐明了检出血清中抗体以诊断疾病的可能性。结核菌的IgG抗体的血清水平与病变程度呈正相关，因此检测血清中IgG 抗体的水平对于疾病的诊断有重要意义。细胞免疫是主要的免疫方式，PPD是检测细胞免疫，血清学方法是检测体液免疫，所以PPD的检出率要高于血清学方法。但是，PPD阳性不能全部包括所有抗体阳性，且PPD阳性牛，也未必有临床表现，而抗体阳性往往意味着病情正在恶化，正是危险的传染源，所以从这方面来看，血清学方法比PPD检测更重要。另外，非典型分支杆菌感染及某些寄生虫病等非特异性因素的干扰，均可引起牛的迟发性变态反应阳性，而体液免疫的水平却很低，这样就使得血清学方法更容易排除假阳性。但牛分支杆菌与其他许多分支杆菌具有类属的抗原性，因此常出现假阳性反应而干扰牛结核抗体的检测。高云航等以草分支杆菌作为吸收抗原处理待检血清，吸收其中的非特异性类属抗体，提高了牛结核EL ISA的特异性。

4 结语

牛结核病的诊断方法有很多，任何检测方法都有其优点和缺点，如与细胞免疫相应的淋巴细胞增生试验和γ－干扰素试验或者因为操作繁琐，或者因为成本高，所用试剂含有放射性物质，难以在基层牛结核病的常规检测中运用；分子生物学检测技术需要贵重的仪器设备，技术复杂，对实验室和操作人员的要求较高等原因，使其在基层常规牛结核病普查中难以运用；目前作为法定检疫方法，结核菌素试验仍然是普查检疫中运用的方法，但它有许多不足之处。所以，牛结核病普查中比较好的做法是，检测细胞免疫的结核菌素试验和检测血清抗体的间接ELISA同时运用，互相弥补不足之处，尽可能的提高检测的敏感性和特异性。在净化牛场时，ELISA检测为阳性的病牛，不管结核菌素试验是否为阳性，都应该进行扑杀处理。结核菌素试验阳性而ELISA检测阴性的牛，应该重复进行结核菌素试验，再结合其他的检测方法，排除非特异性因素的干扰，以降低经济损失。

[1] 蔡宝祥. 家畜传染病学(第4版)[M]. 北京: 中国农业出版社, 2001.

[2] 晓航, 黄伟江, 杜星等. 广州结核疫情内幕曝光: 400多头病牛日日挤奶卖[N]. 羊城晚报, 2003.

[3] 陆承平. 兽医微生物学(第3版)[M]. 北京: 中国农业出版社, 2001.

[4]常晓辉. 临床5种检测结核分枝杆菌方法的比较研究[J]. 上海医学检验杂志, 2002, 17(4): 226-229.

[5] 刘思国, 王春来, 宫强等. 牛分枝杆菌特异性PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 中国预防兽医学报。 2006, 28(01): 80-84.

[6] 何昭阳, 胡希荣, 李振国等. 结核变态反应阳性牛非典型分支杆菌的分离与鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 1994, 25(3): 247-252.

[7] 王振国, 罗雁非, 宋广文. 牛源非典型分枝杆菌的分离与鉴定[J]. 吉林农业大学学报, 1998, 20(2): 73-77.

[8] 张崇贤. 什么阻止我们消除结核病[J]. 结核与肺部疾病杂志(中文版), 1997, 1(1): 3242.

[9] 何昭阳. 牛结核病研究进展[J]. 预防兽医学研究进展, 2001,3(4): 34-39.

[10] 高云航, 何昭阳, 单晓枫等. EL ISA检测牛结核抗体时假阳性反应的消除[J]. 中国兽医学报, 2004,24(5): 419-420.

[11] 路伟, 张秀华, 刘思国等. 牛结核体外免疫诊断技术[J]. 畜牧兽医杂志, 2005, 24(3): 15-17.

（2012–04–18）

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