空肠弯曲杆菌的分离鉴定

马艳辉 （山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）



空肠弯曲杆菌的分离鉴定

马艳辉 （山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）

空肠弯曲杆菌是一种人畜共患病致病菌，作为一种食物源性病原菌，空肠弯曲杆菌能引起人和动物发生多种疾病，其治病机理正在被广泛的研究，本文主要介绍了目前空肠弯曲杆菌相关疾病的研究进展，以及通过实验介绍空肠弯曲杆菌的实验室分离及鉴定的一般方法。

1 相关疾病的情况

1.1 原发性疾病

1.1.1 感染性胃肠炎 空肠弯曲杆菌通过粪，口途径传播，能感染人或动物引起急性胃炎，属人兽共患性疾病，主要症状为腹泻等。空肠弯曲杆菌的黏附、定居、毒素(肠毒素、内毒素、细胞膨胀毒素)及侵袭力为其主要发病机制。食物源性疾病包括中毒性疾病及感染性疾病，因摄入被污染的水或食物而导致致病物进入机体而发病。传染源常为家禽、肉类、鲜奶。国外研究表明有23.1%~98%零售的鸡肉受空肠弯曲杆菌污染，12%的鲜奶受污染。发达国家加工和消费禽肉为主要感染途径。饮用受空肠弯曲杆菌污染的水、未消毒牛奶及与感染动物接触发病。发病常以散发或暴发出现并呈现季节性。

1.1.2 感染性肠外疾病 空肠弯曲杆菌通过其他途径感染可引起多种肠外疾病。孕妇及妊娠期动物感染易导致自然流产、死产、早产。此外，空肠弯曲杆菌感染性肠炎可并发肾小球性肾炎和肾小管间质性肾炎，并在患者粪便和肾活组织检查中分离出空肠弯曲杆菌。空肠弯曲杆菌还与脓毒性关节炎、骨髓炎、眼葡萄膜炎及感染性脑膜炎等疾病有关。

1.2 并发症

急性迟缓性瘫痪性疾病的脑脊液检查有典型的白蛋白-细胞分离现象。急性感染性脱髓鞘性多发性神经根神经病、急性运动神经轴突性神经病、急性感觉神经轴突性神经病、急性运动-感觉神经性神经病以及Miller.Fisher综合征(MFS)，并把这类瘫痪性疾病命名为GBS。主要临床症状为起病急、肌无力，始于下肢，上肢或四肢同时发生，可持续数日或数周。感觉障碍，症状多于4周内达高峰。呼吸肌可受累，部分患者发生上睑下垂或眼外肌麻痹。体格检查可见明显肢体近端或远端无力，腱反射减低或消失。

综上所述，空肠弯曲杆菌相关疾病繁多，传播途径及发病形式多样，尽管有自限性，发病率、接触率高，并发症严重且预后差，近年来常以食物源性疾病发病，尤其是免疫力低下者包括获得性免疫缺陷综合征、血液病及接受化疗等患者易并发严重腹泻，且耐药菌株增加引起局部暴发。目前其发病机制不完全明了，尚无有效的疫苗进行预防，因此，研究有效疫苗将成为预防其感染的最好策略。

2 空肠弯曲杆菌的分离鉴定试验

2.1 材料与方法

2.1.1 培养基 Cary-Blair氏运送培养基、改良Skirrow氏琼脂培养基、空肠弯曲菌琼脂基础培养基及空肠弯曲菌琼脂配套试剂、布氏肉汤。

2.1.2 主要试剂 新鲜绵羊血；新生牛血清；DNA 聚合酶(5U/µl)、dNTPs。

2.1.3 培养基的制备 Cary-Blair氏运送培养基：42g培养基溶于1000ml水中，121℃高压蒸气灭菌15min，冷却至适当温度，无菌分装至5ml EP管中，4℃保存备用。改良Skirrow氏琼脂培养基：43g培养基溶于1000ml水中，121℃高压蒸气灭菌15min，冷却到50℃左右时加入7%冻融绵羊血，1%空肠弯曲菌琼脂配套试剂，无菌倒平皿，4℃保存备用。空肠弯曲菌琼脂基础培养基：42g培养基溶于1000ml水中，121℃高压蒸气灭菌15min，冷却到50℃左右时加入5%新生牛血清，无菌倒平皿，4℃保存备用。

2.1.4 细菌的分离培养 无菌采集待宰牛肛门拭子于灭菌Cary-Blair氏运送培养基，于4℃带回实验室，划线接种于改良Skirrow氏琼脂培养基，置于42.0℃、10%CO2培养箱培养48h，挑取疑似菌落，染色镜检，并进行纯培养。于-80℃冰箱保存。

2.1.5 细菌的鉴定 （1）PCR鉴定。用酚氯仿方法提取细菌的基因组DNA，调整DNA浓度为100ng/μL，作为PCR模板。基因设计的引物(上游引物P1：5'-AGCTAGCT TCGCATAATAACTTG-3'和下游引物P2：5'-GAAGAGGG TTTGGGTGGTG-3')，进行PCR扩增，扩增片段理论长度为750bp(空肠亚种)和500bp(德莱亚种)。反应体系25µl (10×PCR buffer2.5µl，2.5mmol/LdNTP2µl，25mmol/LMg CL22µl，10pmol/µl P1、P2各1uL，5U/µl酶0.2µl，DNA模板2µl，灭菌去离子水补足25.0µl)；反应条件为：95℃预变性5min；94℃1min、57℃1min、72℃1min，共进行30个循环；72℃10min，16℃结束反应，同时设参考菌株阳性、无模板对照。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

2.2 结果

菌落特征与细菌形态在加有7%冻融绵羊血和1%空肠弯曲菌琼脂配套试剂的改良Skirrow平板经42.0℃、10%CO2培养箱培养48h后长出透明、凸起、边缘整齐、直径1~2mm的菌落形态，经空肠弯曲菌琼脂基础培养基纯化培养48h后，呈无色透明、白色或棕黄色或浅红色、圆形、光滑湿润、直径1~2mm的菌落形态，染色镜检为螺旋形、弯曲杆状或似飞翔的海鸥形的革兰氏阴性细菌。

（2012–02–27）

S852.61+2

B

1007-1733(2012)07-0044-02