乙酰肝素酶与肿瘤转移及治疗应用

田野，陈晓鹏

(皖南医学院弋矶山医院肝胆外科，安徽 芜湖 241001)

乙酰肝素酶(也称类肝素酶，heparanase， HPSE)是目前发现的动物细胞中唯一能够降解细胞外基质中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖侧链的内源性糖苷酶，与肿瘤侵袭和转移密切相关，可作为评价肿瘤患者临床预后的一个指标。对于中晚期肿瘤多发转移仍缺乏有效的治疗手段， 基于HPSE在肿瘤侵袭和转移中的作用，针对以HPSE为靶位的肿瘤治疗不失为一种新的有效的途径。本文就国内外研究关于HPSE与肿瘤的侵袭和转移关系及治疗的研究现状进行综述。

1 HPSE的分子结构

HPSE基因由Vlodavsky等[1]于1999年相继克隆，定位于4q21.3，长度近39 kb，含有13个外显子和12个内含子，cDNA全长约有1 758 bp。 Jiang 等[2]报道HPSE基因的启动子区为3.5 kb，富含GC，TATA含量少，符合管家基因启动子的特点。其基因上游近端的0.3 kb区有很强的基础启动子活性，内含三个Sp1和四个ERE ( Ets-relevant elements)结合位点，其mRNA的转录起始于密码子上游101 bp处。HPSE基因编码分子量为61 192 Da的蛋白质，即HPSE蛋白前体，其不具有活性。前体多肽链有2个疏水区和1个亲水区，N端第160氨基酸残基附近亲水性最强，易于暴露和被专一蛋白酶在glu157-lys158处水解，切除N端157个氨基酸残基后，含386个氨基酸残基的C端便成为活性很强的成熟蛋白，分子量约为50 Da，即成熟的、有活性的HPSE[3]。

2 HPSE的功能

HPSE通过降解硫酸乙酰肝素，破坏细胞外基质及基底膜的完整性，使基质中储存的大量生长因子如碱性成纤维因子和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)释放，与炎症、免疫、伤口愈合等多种生理病理过程密切相关[4]。有研究表明HPSE既通过释放肿瘤环境和细胞外基质中储存的高活性VEGF促进血管生成外，还可以直接促进VEGF的表达。同时，HPSE还能降解正常组织屏障中的主要成分，有利于肿瘤细胞游出，单独或协同VEGF促进肿瘤微血管的生成，促进肿瘤的侵袭及转移[5]。El-Assal等[6]也证实肝细胞癌中HPSE的表达水平与肿瘤微血管密度呈显著的正相关性。

3 HPSE与恶性肿瘤

3.1 HPSE与肝癌 HPSE的表达高低与肝癌的大小、肝内或淋巴结转移密切相关。淋巴结和肝转移都是反映肿瘤侵袭性的指标，提示HPSE对肝癌的侵袭转移有重要的作用[7]。研究发现，HPSE与肝癌组织的分化程度密切相关，相对于高、低分化的肝癌组织HPSE阳性表达率更高，说明HPSE在肝癌的生长中起着一定的促进作用。邓茜等[8]对165例肝活检和对肝楔形切除石蜡标本的研究提示，HPSE阳性细胞定位于肝细胞内，呈弥漫片状、小巢状或散在分布。肝癌HPSE mRNA表达与患者年龄、性别、癌灶大小、包膜完整度、乙型肝炎病毒表面抗原(epatitis B surface antigen，HbSAg)状态、甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)和有无肝硬化等因素无关，而与癌灶Edmondson分级、原发肿瘤局部淋巴结远处转移分期、转移复发倾向和有无转移复发有关。HPSE干扰序列能有效抑制肝癌的增殖、侵袭以及成瘤能力，HPSE过表达可以明显促进小鼠肝癌细胞血道转移和淋巴转移[9]。有学者运用反转录酶-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)研究显示47%的肝癌组织中HPSE mRNA及HPSE蛋白的表达显著高于癌旁组织及正常肝组织(P<0.05)；并证实HPSE表达阳性与肝癌术后转移复发呈正相关，说明HPSE的表达可能与肝癌恶性转化及肿瘤的演进有关[10]。因此， HPSE也可以成为肝癌术后转移复发的预测指标[11]。

3.2 HPSE与垂体肿瘤 HPSE能够降解硫酸乙酰肝素，破坏细胞外基质的完整性，在与细胞外基质重塑相关的多元化进程，如形态发生、血管生成和肿瘤浸润密切相关。Rubinfeld等[12]采用RT-PCR和免疫组化法检测了人正常垂体组织和垂体瘤中HPSE mRNA和蛋白的表达水平；运用细胞菌落形成实验检测了HPSE对垂体瘤GH3和MTT/S细胞增殖的影响。研究结果表明垂体瘤中HPSE mRNA和蛋白表达水平较正常垂体生长激素高。HPSE基因沉默后，细胞活力下降50%。综上，HPSE增强了垂体细胞活力和增殖，从而可能促进了垂体瘤的发生和发展。

3.3 HPSE与其他肿瘤 HPSE促进肿瘤细胞侵袭及诱导VEGF表达， 增加淋巴管的密度， 调动转移性细胞。Hoffmann等[13]通过RT-PCR 检测胰腺癌组织中HPSE表达发现： 在高侵袭性胰腺癌中， HPSE高表达， HPSE与淋巴结转移数目显著相关。Cohen等[14]通过免疫组织化学、相关临床病理资料分析以及HPSE免疫和细胞定位方法对表达HPSE的114例肺癌患者进行了研究发现HPSE表达与肺癌淋巴结转移呈正相关， 和患者生存呈负相关。Inamine等[15]研究表明在子宫内膜癌中， HPSE的表达可促进肿瘤侵入肌层和淋巴结血管间隙。而肿瘤突破基膜侵入存在丰富血管、淋巴管网的黏膜下层， 即是肿瘤远处转移的前提。HPSE与慢性炎症性肠病、结肠肿瘤及结肠炎相关的癌症有着重要作用。高度协调小肠HPSE和免疫细胞之间的相互作用(即巨噬细胞)，保留了慢性炎症条件，并创建了一个促进肿瘤发生的微环境[16]。最近HPSE的功能单体被发现，其中包括重要的SNP rs4693608，其在HPSE的单核苷酸多态性中发挥了重要的作用，与胃癌进展和生存密切相关，可能是一个重要的预后和具有治疗价值的分子标记物[17]。

4 HPSE用于肿瘤的治疗

4.1 免疫治疗 基于HPSE细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位的广谱肿瘤疫苗的研究、抗原提呈细胞如树突状细胞(Dendritic cells ，DC) 的肿瘤免疫治疗，HPSE 作为一种广谱的肿瘤转移抗原成为理想的肿瘤共有抗原。人及小鼠HPSE抗原表位在体内、外均可诱导产生HPSE 多肽特异性的CTL反应， 对HPSE阳性且主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex ，MHC) 相匹配的肿瘤细胞具有明显的杀伤效应。研究表明， HPSE抗原表位对肿瘤小鼠具有明显的免疫保护和免疫治疗作用[18]。Sommerfeldt等[19]亦从HPSE氨基酸序列中设计了3条受组织相容性抗原(human leukocyte antigen-A2 ，HLA-A2)限制的HPSE抗原表位，即HPSE8-16、HPSE16-24、HPSE183-191，其负载的DC 细胞均可以产生HPSE特异性的CTL， 对HPSE阳性且HLA-A2阳性的乳腺癌细胞( BT-20、BT-549 及BT-124) 具有明显的杀伤效应， 而对HLA-A2阳性但HPSE 阴性的MCF-7乳腺癌细胞不具有杀伤效应。以上研究进一步表明， HPSE可以作为一种广谱的肿瘤相关抗原用于肿瘤的免疫治疗。

4.2 基因治疗 Xiong[20]等以肝素酶编码区域作为靶点分别设计了三个(small interfering RNA ，siRNA)并克隆成pGenesil-1载体，转染肝癌细胞与裸鼠。结果发现siRNA-1 (1214-1232)与siRNA-3 (611-629)转染的肝癌细胞中HPSE显著降低，有效的抑制了肝癌细胞的增殖能力。转染的裸鼠中肝癌细胞的侵袭与成瘤能力也受到抑制。王成友等[21]通过设计针对小鼠肝癌细胞Hepa1-6HPSE mRNA的小干扰RNA(siRNA)，观察RNA干扰(RNAi)对小鼠肝癌细胞Hepal-6中HPSE表达的抑制作用提示：HPSE siRNA可显著抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6中HPSE mRNA和蛋白质的表达。这些结果提示，HPSE特异性RNA干扰作为一种新肝癌治疗剂的潜在价值。

4.3 疫苗治疗 多肽疫苗对癌症进行免疫疗法需要鉴定多肽表位的抗原蛋白。Chen等[22]通过筛选发现HPSE525、HPSE277及HPSE405肽相对于其它肽更能促进T细胞的产生干扰素(interferon-γ，IFN-γ)从而增强了机体非特异性抗肿瘤的能力。HPSE525、HPSE277及HPSE405肽是新的HLA-A2限制性CTL抗原决定簇， 在体外研究中能够诱导HPSE特异性CTL的作用。因此上述肽疫苗均可用于免疫疗法治疗晚期肿瘤。Yang等[23]研究发现多重抗原肽(multiple antigen peptide，MAP)，MAP1(AC1-15)和MAP2 (AC279-293 )在人类HPSE蛋白中可能是占主导地位的B细胞抗原决定簇， 诱导多肽抗体产生可以有效地抑制HC-CLM6肝癌细胞的HPSE活性， 从而影响其侵袭和转移的能力， 为发展抗HPSE抗体及临床使用的疫苗提供了理论依据。

4.4 临床药物治疗 类肝素衍生肽引起一种强有力的抗肿瘤免疫反应，表明肝素对肿瘤有相应的靶抗原[24]。此外，肝素能作为HPSE的底物， 延缓HPSE对硫酸乙酰肝素的降解。肝素片段无论抗凝活性的高低， 都表现出相似的抗HPSE和抗转移活性[ 25， 26]。体外实验证明其具有很好的抑制血管生成和抑制HPSE活性的作用，已经进入3期临床试验，用于肝细胞癌切除术后辅助治疗，显示了良好的抗肿瘤效果[27]。

5 展望

近年来随着对HPSE研究的深入，HPSE新的功能逐渐被报道出来。尤其在肿瘤的侵袭和转移中，HPSE发挥着重要的作用。但是HPSE在肿瘤侵袭、转移中的机制仍不十分清楚，进一步阐明其作用机制是我们目前急需解决的问题，可以为临床发展以HPSE为靶点的免疫治疗、基因治疗、疫苗治疗、药物治疗提供可靠的理论依据。综上所述， HPSE有望成为肿瘤早期诊断、病情评价、临床治疗及预后监测的一个重要的综合指标。

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