牛奶中青霉素近红外光谱定量分析

马小红，赵武奇*，谷 月，李晓丹，张 哲，田 蜜

（陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062）

牛奶含多种营养成分，被认为是“接近完善的食品”。在我国，随着人们生活水平的提高，乳制品逐渐成为人民生活必需食品，这一消费需求有力地推动了乳品行业的发展。乳品行业成为我国新兴而又极具发展潜力的食品行业，被社会公认为“朝阳产业”[1]。2010年，我国乳制品总产量2159万t，比2005年增长79%，行业销售额达到1717.50亿元人民币，利润总额为89亿元。但是我国目前乳品行业在发展机遇面前，却面临着乳品质量安全和生产加工过程的卫生状况良莠不齐这一严重问题的干扰。抗生素残留是目前影响乳制品质量安全的主要因素之一，抗生素通过食物链进入人体，对人体的健康构成严重的威胁。因此，联合国粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）的食品法对牛奶中抗生素残留量限量都有明文规定，欧盟（EC）和美国食品药品监督管理局（FDA）也有严格规定，禁止抗生素残留超过最高残留限量的牛奶及制品上市。牛奶中抗生素残留的检测方法主要有微生物检测法、理化检测法和免疫学分析法，但这些检测方法都具有不同程度的局限[2]。近红外光谱（NIR）分析技术是20世纪70年代发展起来的一项高效、快速、无损、绿色的定性定量分析技术，已广泛应用于石油化工、农业、制药、食品、烟草工业、生命科学以及环境保护等领域[3]，在近红外光谱检测牛奶品质方面，COPPA M等[4]预测了牛奶中的脂肪酸组成，HSIEH CL等[5]预测了山羊奶的密度、脂肪及无脂固形物含量，BALABIN RM等[6]建立了液态奶中三聚氰胺的定量分析模型，李亮等[7]实现了对掺有植物性填充物牛奶的快速定性、定量鉴别，朱向荣等[8]对液态奶中蛋白质和脂肪含量进行预测，李晓云等[9]建立了牛奶中脂肪、蛋白质和干物质含量的定量分析模型。目前各养殖场特别是小规模奶牛饲养户抗生素滥用现象十分严重，并且抗生素使用剂量也越来越大，造成抗生素在大部分牛奶中的有残留。因此研究牛奶中抗生素的快速检测方法具有现实意义，本文探讨近红外光谱无损检测牛奶中青霉素的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

从超市购买3种不同厂家但是每种样品为同批次的纯牛奶。按国家标准GB/T4789.27-2003食品卫生检验方法微生物学检验方法氯化三苯四氮唑（TTC）法，对鲜牛奶中抗生素残留进行检测和结果判定[10]。筛选出不含抗生素的牛奶作为试验的样品。

青霉素标准品（纯度96%），TTC（2，3，5-氯化三苯四氮唑，嗜热乳酸链球菌，氯化三苯四氮唑，多功能近红外光谱仪InfraXact（瑞典福斯公司）。

1.2 样本集的制备

配置青霉素浓度分别为0、4×10-9g/L、10×10-9g/L、20×10-9g/L、30×10-9g/L、40×10-9g/L、50×10-9g/L、60×10-9g/L、70×10-9g/L、80×10-9g/L、90×10-9g/L、100×10-9g/L、120×10-9g/L、150×10-9g/L、180×10-9g/L、200×10-9g/L、220×10-9g/L、250×10-9g/L、280×10-9g/L、300×10-9g/L等不同梯度的84个牛奶样本，为了更加接近于实际分析的样品，将配置好的牛奶在4℃的冰箱里放置72h，对每一样本进行近红外光谱扫描。

1.3 样品光谱采集

测量时，将样品置于杯中，数据采集频率为每次扫描3秒，光谱数据间隔为2nm，每个样品重复扫描30次，通过计算机运行InfraXact光谱仪自带的ISIscan软件，获取光谱数据并存储。扫描前，仪器需预热1h，自检通过后方可正常使用。扫描过程中保持室温25℃左右，并严格控制室内湿度，保持环境的一致性。

1.4 异常样品的剔除及样本集的划分

利用马氏距离剔除异常样品，设置GH=3.0，含义为得分的三维图中，每个样品距离中心样品点的距离为标准变异单位的3倍，马氏距离超过3.0的被视为异常样品，均被剔除。将经过异常剔除后的样品按样品序号采用隔八选一法进行分集，定标集和验证集样品个数比例约为7:1。

1.5 定标模型的建立

将不同的校正方法和预处理方法对模型的影响设计成正交试验。选取L27（313）正交表[11]，将因素分别安排在1、2、4、8、11、13列进行试验，以函数f=R/（1+SECV）为目标来评估模型的性能（R为定标决定系数，SECV为交叉验证标准差），表1为试验因素水平表。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factor and levels of orthogonal test

1.6 定标模型的验证

以验证集样品作为未知样品进行预测，通过预测决定系数（R2）及预测集标准偏差（SEP）的大小来验证模型的预测能力。

2 结果与分析

2.1 样品的近红外反射光谱图

附图为样品的近红外反射光谱图。由光谱图可以看出，液态奶制品的特征吸收波段大约在1200nm-1～1850nm-1内。青霉素中含有C=O、C-N、S-C、苯环等基团，在1200nm-1～1300nm-1内高倍频吸收较弱，该区域包括C=O、C-N、S-C等键的伸缩振动吸收；在1300nm-1～1850nm-1区域的峰是由伸缩振动产生的吸收带，苯环、C=C等键主要存在于此吸收波段，它是基团鉴定的区域也被称为官能团区，丰富的光谱信息对牛奶中青霉素的近红外光谱定量分析提供了大量的信息。

附图 含青霉素牛奶的近红外反射光谱图Attached Fig.Near infrared reflectance spectrum of milk with penicillin

2.2 样本集划分结果

表2为样本集划分结果，可以看出校正集与验证集的分布比较均匀，合理，具有较好的代表性，验证集样本也都被包容在校正集的空间内，满足建立近红外分析模型要求。

表2 样本集划分结果Table 2 Partitioning results of samples

2.3 正交试验结果

由表3可以得出，牛奶中青霉素的最佳水平组合为A3B2C2D3E3F3，即定标方法为改进偏最小二乘法（MPLS），散射校正为标准正常化+趋势变化法散射处理（SNV+D），导处理为1阶、导数处理间隔点为8、平滑处理间隔点为8，二次平滑处理间隔点为8。

2.4 模型的适用性检验

模型建立后，用验证集对模型进行验证。验证结果如表4。

由表4可以看出，青霉素检测的最佳模型的决定系数R2为0.975，具有很高的相关性。相对标准差为12.87略大于10%，但相对分析误差为6.1758大于3，说明取得了良好的预测效果，所建立的定标模型可用于实际检测，可看出所建立的模型有较好的预测性和适用性[12]。

3 结论

通过以上试验表明：利用近红外技术可以快速无损的检测出牛奶中抗生素的含量，且其精度能达到ppb级（μg/L）。利用近红外光谱技术快速无损的测定牛奶中抗生素的含量的技术在牛奶市场上具有很高的利用价值，可以实现生产线上的在线检测。如将该技术应用于测定牛奶甚至是其他食品中各种成分尤其是有害成分的微量测定将会更有意义。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment

表4 最优模型验证结果Table 4 Validation results of optimal models

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