调节性T细胞在过敏性鼻炎及抗原特异性免疫治疗中的作用

娄 玮 王成硕 张 罗

(首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科北京市耳鼻咽喉科研究所耳鼻咽喉头颈科学重点实验室，北京100730)

过敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)其发生机制主要是特应性个体(atopic individual)接触变应原后发生以IgE介导的鼻黏膜慢性炎性反应，整个反应过程中多种炎性细胞参与其中，包括效应T细胞、自然杀伤T细胞，嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞，静息的组织细胞和调节性T细胞(regulatory T cells，Treg细胞)等［1-2］。大量研究［3-4］显示 Treg 细胞作为免疫负调节的角色出现，在免疫耐受中发挥着举足轻重的作用。动物的实验研究显示，过继性转移Treg细胞可防治或减轻T细胞介导的疾病，包括变态反应性疾病、哮喘、自身免疫性疾病、移植免疫排斥反应等，它可使机体对变应原、自身抗原、异体抗原形成免疫耐受。因此，诱导机体产生抗原特异性Treg细胞已经变成治疗过敏性疾病的一大目标，临床研究结果表明抗原特异性免疫治疗是目前唯一能诱导人体产生抗原特异性Treg细胞的有效手段。而对Treg细胞在过敏性鼻炎发病及抗原特异性免疫治疗中的作用研究仍在探索之中。

1 调节性T细胞

广义而言具有免疫抑制或免疫调节作用的T细胞统称为调节性T细胞(Treg细胞)，它能防止机体对自身抗原或环境中的无害抗原包括过敏原产生免疫反应，它们限制机体对抗致病原的免疫反应以减少因清除病原体而导致的组织自身免疫损伤。然而，众所周知NK细胞，NKT细胞，CD8+T细胞，B细胞和肥大细胞等都具有重要的免疫调节作用，但目前学者将焦点放在了CD4+Treg细胞上，主要是由于其能产生且扩增与疾病相关抗原特异性抑制细胞［5-7］。

1.1 调节性T细胞的来源及分类

早在20世纪70年代人们就发现了机体中存在一群具有免疫抑制作用的细胞，但一直苦于没有明确的细胞表面标记，使研究一直处于停滞状态。到20世纪90年代，人们对Treg细胞有了进一步的认识。根据来源的不同人们将Treg细胞人为的分成天然Treg细胞(natural regulatory T cells，nTreg细胞，主要为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞)和诱导Treg细胞(inducible regulatory T cells，iTreg细胞，主要包括 CD4+CD25+Foxp3+Foxp3-Treg细胞，Tr1，Th3 等)，nTreg主要来源于胸腺，其发育时期即作为抑制针对自身抗原反应的T细胞亚群而存在，主要特异性针对自身抗原发挥免疫抑制/调解作用。iTreg细胞是来自胸腺的幼稚T细胞(naïve T cell)在外周经抗原诱导分化而发育成熟而获得免疫抑制活性，主要针对外源性的抗原发挥作用。

至于胸腺来源的和外周诱导的Foxp3+Treg细胞在过敏性疾病中的作用孰重孰轻目前仍难以定夺。外周免疫诱导作为一重要机制主要针对外源性的或环境中的抗原(包括变应原)产生特异性的Foxp3+Treg细胞，并且这群细胞随着年龄的增长会持续存在，这一理论在小鼠的实验模型中已得到证实，针对过敏性呼吸道疾病的Foxp3+Treg细胞被成功诱导。另外一群具有分泌大量IL-10的Treg细胞被称作Tr1细胞(或称IL-10-Treg细胞)，这群细胞被认为在特异性维持气道免疫环境稳定中发挥重要作用［3］。而分泌TGF-β的Treg细胞(Th3细胞)主要与肠道免疫有关［8］，但同时也会在肺部炎性反应清除病变的同时，促进纤维化与组织重塑等。

1.2 调节性T细胞的标记

长期以来使Treg细胞的研究一直处于争议之中的关键就是缺乏独特的细胞表面标记来定义这些免疫抑制细胞。学者们最先发现天然Treg细胞和部分诱导Treg细胞表面稳定地表达IL-2受体(IL-2R)的α链，即CD25，因此将CD4+CD25+T作为Treg细胞标记，然而CD25可以表达在所有活化的T细胞表面，一直以来以CD4+CD25+T作为Treg细胞标记试图对过敏性疾病中的Treg细胞功能进行研究，不同的研究组采取各自的方法分离，研究同一细胞，所得出的结论不同甚至是矛盾，使得对该病的认识陷入泥潭之中。此外的细胞标记还包括 CD62L，CTLA-4，GITR等［9］，但多数均证实也被活化的效应T细胞所表达。

后来人们发现，Foxp3，一个叉头/翼状螺旋转录因子，被报道是CD4+CD25+Treg细胞特有的一个标记物，它表达在大多数的CD4+CD25highT细胞和少部分CD4+CD25intT细胞，且其与CD4+CD25+Treg细胞表型和功能的维系密切相关。将Foxp3转入幼稚T细胞(naïve T cell)内可使其产生类似 CD4+CD25+Treg细胞的表型特征［10］，如细胞表面表达 CD25、CTLA-4等抗原，并具备抑制活性。但同时在人类Foxp3的表达可以在活化的效应T细胞被短暂的诱导，可又不具有Treg细胞的功能。且因其是核蛋白，从分离Treg细胞的角度讲Foxp3的意义是有限的。然而，尽管如此，人们想尽办法，展开了大量的Treg细胞在过敏性疾病中的功能性研究，如 CD25+，Foxp3+，CD127-等标记表型划定了一群有意义的Treg细胞。迄今为止，还没有发现关于Tr1细胞和Th3细胞特异性的表面标记。

1.3 调节性T细胞的作用机制

关于Treg细胞的作用机制目前仍不十分清楚。Treg细胞可以通过一系列的免疫学机制(包括依赖细胞接触途径、竞争细胞生长因子、细胞毒性、分泌抑制因子等)抑制T淋巴细胞、抗原递呈细胞和幼稚细胞的功能。而多数的研究［4，10］表明通过分泌细胞抑制因子如IL-10，TGF-β是其发挥作用的主要方式。

多数的研究者都一致认为尽管不同种类的Treg细胞均具有抗原特异性，但却以非抗原特异性的途径发挥着免疫抑制作用。像目前比较清楚的有Th3细胞通过分泌TGF-β、Tr1细胞通过分泌IL-10发挥免疫抑制作用。相比较而言，多数报道指出CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞在人和小鼠中主要是依赖细胞接触机制发挥作用。但是Treg细胞表面分子及其在免疫抑制过程中的作用途径目前还不十分清楚。

而无论是人或鼠，CD4+CD25+Treg细胞都是通过细胞连接依赖性机制发挥作用的。但参与该细胞连接介导的抑制机制的表面分子和信号途径尚未能明确。其细胞膜表面的CTLA-4和可溶性TGF-β提供免疫抑制信号已被证实［11］。在小鼠和人的实验研究中有报道［12］，CTLA-4和可溶性 TGF-β 的联合作用可阻断靶细胞CD4+或CD8+CD25-T细胞增生和功能实现。通过对胸腺的 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞抑制机制研究［13］表明Th2细胞较Th1细胞对CTLA-4/mTGF-β介导的免疫抑制机制更为敏感。可是在后来的报道中有研究［14］显示依赖CTLA-4/mTGF-β介导的免疫抑制途径的机制遭到质疑，因为在缺乏TGF-β1的情况下CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制作用依旧存在。值得注意的是，有研究［15］表明TGF-β在Treg细胞抑制活性和Foxp3的表达和(或)维持上发挥不可或缺的作用。在人体，经过TGF-β治疗后自然和诱导CD4+CD25+Treg细胞能对CD4+CD25-T细胞更好的发挥免疫抑制作用，而在小鼠实验中却未能得到同样的验证。CTLA-4在CD4+CD25+Treg细胞抑制活性中的作用主要表现在上调同一细胞表面的TGF-β的表达。相反，CD4+CD25+Treg细胞表面的另一类分子GITR在TGF-β的存在下，在抗-GITR抗体或刺激GITR配体作用下削弱CD4+CD25+Treg细胞的抑制作用，起到了负调节的作用［16］。

2 调节性T细胞在过敏性鼻炎发病机制中的作用

特应性个体在遇到过敏原后不能正常地建立起免疫耐受状态，继而发生过敏性炎性反应。整个的免疫反应过程，可被分为炎性细胞活化、靶器官迁徙、存活、激活及免疫细胞的效应反应［17］。过敏性炎性反应发生的初始阶段主要是抗原特异性CD4+T细胞的产生，T细胞可以被吸入过敏原活化，它们在鼻相关的趋化因子网的作用下发生器官选择性迁徙，从而炎性反应细胞在局部组织存活发生炎性反应［18］，在IL-4的作用和持续的抗原刺激下，未分化T细胞被抗原递呈细胞活化，向Th2细胞分化。而抗原特异性Th2细胞的活化导致大量Th2细胞因子的产生，包括IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等，从而介导重要的免疫调节和效应作用。这些因子诱导B细胞产生抗原特异性IgE(大部分的IgE产生是在淋巴组织和骨髓完成，在局部组织如鼻黏膜也可观察到局部IgE的产生)，炎性反应的发展及嗜酸性粒细胞向局部组织迁徙，黏液产生［19］。IgE介导的嗜中性粒细胞和肥大细胞脱颗粒导致了I型变态反应炎症的发生。而Th1细胞促成了过敏性炎性反应的形成及效应阶段，特别是在活化和促进静息的组织细胞凋亡［20］。

过敏性炎性反应中，T细胞作为一个重要的细胞亚群在局部组织中大量浸润，产生免疫失调反应，而这种“失控”状态促使了过敏性炎性反应的持续存在。然而在正常个体和成功免疫治疗的个体中，Treg细胞通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子或细胞-细胞接触机制参与到了整个抗原特异性外周免疫耐受的调控过程，如抑制抗原特异性IgE产生、诱导非炎性抗体IgG4等的产生，抑制肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的过敏性炎性反应。更重要的是Treg细胞抑制Th2细胞的细胞因子的释放，如IL-4，IL-5，IL-9和IL-13等，从而间接抑制了细胞的分化、局部存活、部分细胞的活化(如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等)及Th2细胞归巢等。此外抑制Th0/Th1细胞诱导转化，从而减少局部组织的损伤。

既然Treg细胞在外周免疫耐受中发挥重要的调节作用，那么其在过敏性炎性反应的发病中的作用如何呢?有研究［21］显示，在特应性个体中，抗原调节性Treg细胞数量和(或)功能存在缺陷。部分研究［22］表明，过敏性儿童的Treg细胞在过敏季节数量增加。部分研究［23］中外周抗原特异性 CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞在特应性个体和健康个体中未发现显著差异。但却有研究［24］证实Foxp3的表达与IgE，嗜酸性粒细胞，IFN-γ的水平呈负相关，FOXP3+/CD4+的比率在过敏性个体中显著降低。通过细胞因子谱化分T细胞亚群，分别以分泌 IFN-γ，IL-4，IL-10的抗原特异性CD4+T细胞代表Th1，Th2和Tr1细胞，研究显示，虽然在健康个体和变应性个体中这3种细胞亚群均存在，但是比例有所不同。研究［21］表明在健康个体中主要表现为可探测的以抗原特异性的IgG反映为主，Tr1细胞作为主要细胞亚群针对环境中的一般抗原反应。在过敏性个体中是以分泌IL-4的Th2细胞反应为主。因此效应Th2细胞或Tr1细胞在外周所占的比重决定了机体免疫状态。

3 调节性T细胞在抗原特异性免疫治疗中的作用

目前，过敏性鼻炎症状可通过抗组胺药物、抗白三烯药物、糖皮质激素药物等得以缓解，但这只是暂时的抑制IgE介导的过敏性反应(如过敏性鼻炎、过敏性结膜炎等)。而抗原特异性免疫治疗对过敏性疾病的治疗远期疗效却是显著的，它不仅可抑制过敏反应的发生，还可有效改善过敏症状，并可以防止其对新的过敏原产生过敏反应［25］，降低过敏性鼻炎患者发展成为哮喘的概率［26］。尽管其在临床中的应用已近一个世纪，然而其作用机制仍在探索之中［27］。

3.1 SIT调节Th2-Th1反应平衡

一直以来人们认为，过敏性炎性反应是由Th1-Th2细胞反应失衡所导致，因而大量学者将免疫治疗机制研究放在了Th1-Th2细胞的免疫反应平衡中，研究显示成功的抗原特异性免疫治疗的确可以使免疫反应从以Th2细胞反应为主向Th1细胞反应方向偏移［28-29］，而随着研究的不断深入及认识的不断加深，发现这一理解未免有些片面，在过敏性炎性反应的发生的整个过程中均需要外周T细胞的活化，因此T细胞的免疫耐受可减少或终止以上反应的发生。

3.2 SIT诱导外周Treg细胞形成免疫耐受

外周抗原特异性免疫耐受的诱导是抗原特异性免疫治疗的关键。外周T细胞的免疫耐受主要是诱导产生抗原特异性Treg细胞，从而抑制效应细胞的活化及增生，主要表现为在其遇到抗原后显示为“无能”，从而克服变态反应中的速发象和迟发象反应。外周抗原特异性免疫耐受涉及多个抑制因子，如IL-10、TGF-β、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)等。因此，抗原特异性外周T细胞免疫抑制通过IL-10、TGF-β等细胞因子(主要是由Tr1细胞自分泌产生)介导发挥作用。临床研究表明，在经过抗原特异性免疫治疗的个体上调了CD4+CD25+Treg细胞的抑制细胞增生作用，在经过花粉免疫治疗之后增加了外周血和黏膜组织中的 IL-10［30］和 TGF-β［31］的表达。对蜂毒过敏的研究可作为抗原特异性免疫治疗机制研究的经典模型，经历多次蜂虫叮咬之后，蜂毒抗原特异性Th1和Th2细胞克隆增生，同时向分泌IL-10的Tr1细胞反应转化，结果减少了T细胞介导的皮下迟发反应的发生，抑制抗原特异性T细胞的增生和Th1和Th2细胞因子的分泌。除此之外，抗原特异性免疫治疗能有效的调节肥大细胞、嗜碱性粒细胞活化阈值减少IgE介导的组胺释放［32］。此外，IL-10减少肥大细胞致炎因子的释放，还下调嗜酸性细胞的功能、活化，抑制IL-5的产生。另外，还发现肥大细胞和嗜酸性粒细胞数量的减少 ，包括相应介质释放的减少［33］，然而这些免疫学的改变往往伴随着外周血中调节性T细胞数量(CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞，Tr1细胞)的增加和(或)功能的提高，这些可以说是诱导T细胞免疫耐受的结果。

3.3 SIT诱导Treg对血清抗体的调节

哪些Treg细胞能调节B细胞作用而调节血清抗体的产生是问题的关键。对小鼠的研究［34］显示，CD4+CD25+CD69-Treg细胞可转移到生发中心，以负性调节B依赖T细胞的抗体产生。尽管通过免疫治疗的外周T细胞的免疫耐受形成得到证实，而特异性免疫治疗期间B细胞产生抗原特异性IgE，IgG4抗体的能力没被抑制［35］。研究证实健康个体中针对尘螨抗原血清中的抗体主要是特异性IgA和IgG4，伴随少量的IgG1反应和极其少量的IgE。在免疫治疗的早期血清中抗原特异性IgE、IgG4抗体的水平升高，其中IgG4抗体升高的尤为显著，IgE/IgG4比率的降低可达到10～100倍。IL-10对总的和抗原特异性IgE具有潜在的抑制作用，而同时可刺激抗原特异性IgG4的产生。对治疗初期的研究［36］证实，70 d的屋尘螨抗原特异性免疫治疗没有显著降低抗原特异性IgE水平，然而却显著增加了大量的 IgA，IgG1和IgG4［36］，这些抗体的增加同时伴随着血清中IL-10和TGF-β的增加。这些研究表明抗原特异性免疫治疗中，Treg细胞除了有抑制效应细胞的增生及反应的能力，同时还调节血清中的抗体水平。

3.4 SIT诱导局部组织Treg表达

研究表明抗原特异性免疫治疗的确使外周血中免疫状态发生改变，那么在外周局部组织的反应是否也是如此呢?有学者观察经过花粉特异性免疫治疗后鼻黏膜的T细胞反应，研究显示经过治疗后增加了T细胞的IL-10 mRNA的表达，然而，与在外周血中观察的结果不同的是抗原的暴露并未增加非特应性个体的局部组织中IL-10的表达。经过抗原特异性免疫治疗之后，局部鼻黏膜组织中的Th1细胞的活化及CD4+CD25+T细胞在局部黏膜的增加得到证实［37-38］，不能完全反映外周的免疫耐受状态，主要与反应的不同阶段有关，如细胞凋亡，细胞转移，细胞归巢，存活信号，这些都和抗原暴露及环境因素有关。

4 展望

近年来人们对Treg的认识不断深入，关于Treg细胞与过敏性疾病的关系的研究已经引起了变态反应学界的高度重视。Treg细胞在维持自身内环境稳定和免疫耐受的形成过程中具有不可替代的作用。而Treg细胞的形成或功能的缺陷与过敏性鼻炎有着密切关系，对于其功能调控机制的研究也就自然成为了呼吸道变应性疾病研究的一个重要靶点。尽管在过去的十几年间学者作出了巨大努力，但有关这些细胞从识别、分离，到作用机制和免疫生物学特性的研究，乃至到进一步的治疗策略的临床开发与应用都存在未知。但我们坚信只要坚持不懈地走下去相信一定会在基础和临床研究方面取得重大进展，造福于病患。

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