利用孕妇血浆中胎儿游离DNA进行无创伤性产前基因诊断的研究进展

喻 琼，邓志辉

(深圳市血液中心，广东 深圳 518035)

1997年，Lo等[1]首先发现孕妇血浆中存在游离(cell-free)的胎儿DNA。直接利用孕妇外周血中的胎儿DNA，对胎儿的遗传信息进行无创伤性产前基因诊断，因无须穿刺或中止妊娠、对胎儿无任何创伤、可在妊娠早期进行、适合于继续妊娠对象等众多的优点，倍受临床围产医学研究者的关注和重视。

孕妇血浆中胎儿游离DNA源于胎儿细胞和/或胎盘的凋亡[2，3]，相对含量丰富，在妊娠早期平均为 0.022～0.46ng/ml， 妊娠晚期为 0.46～5.08ng/ml，孕中期和孕晚期的孕妇血浆DNA浓度高于孕早期[4]；并且分娩后，孕妇血浆中胎儿游离DNA很快被清除，不会影响到下次孕娠。因此，胎儿游离DNA成为当前无创伤性产前遗传分析的重要来源。近年来，国内、外已有较多的应用研究文献报道。

1 性别遗传鉴定

目的是为了避免X-连锁隐性遗传性疾病，以利于优生优育。目前X连锁隐性遗传病有200多种，如杜兴肌营养不良，女性携带者和正常男性婚配，女婴为携带者的风险为50%；而男婴则有50%的患病风险。在性别遗传鉴定方面的研究，开展较早，国内外报道较多。如采用PCR技术、巢式PCR技术、荧光定量PCR方法检测Y染色体上的SRY基因、锌指蛋白基因(Zinc finger protein,Y-encoded,ZFY)，以及采用PCR复合扩增和荧光法基因扫描检测Y-STR等位基因，总符合率与孕周、血浆DNA提取方法及采用的检测技术等相关，业已报道的总符合率介于90%～100%[5-8]。

2 RhD阴性孕妇的Rh(D)基因检测

除胎儿性别鉴定外，首先引起研究者重视的是：Rh阴性孕妇的Rh(D)基因检测[9]。Lo等采用荧光定量PCR技术，检测12名早孕期、30名中孕期和15名晚孕期RhD阴性孕妇的血浆DNA，除2名早孕期的样本因模板DNA量少、出现假阴性外，其余的55例样本的Rh(D)检测结果完全正确[4]。此后的研究者以Rh(D)基因的不同区域作为靶基因，相继开展了研究工作，取得了较为可靠的结果[10-13]，特别是中孕期以后孕妇样本。

3 常染色体STR及X染色体STR基因座检测

直接利用孕妇血浆总DNA，采用荧光法复合扩增检测胎儿的常染色体STR等位基因，可获得男婴或女婴的STR遗传多态性信息。荧光法的检测所需模板DNA量少、检测灵敏度高、人为因素造成的误差小。Pertl等[14]自行合成、标记荧光引物，建立复合扩增系统，检测12对母-子对，9个STR位点中至少可检出4个父源性胎儿STR等位基因，检出率为80%。Nelson等[15]采用荧光法单个位点扩增GATA72E05等5个X-STR基因座，检测25例孕娠女婴的孕妇血浆DNA，19例(76%)至少检出了一个胎儿特异性等位基因，并建议中孕期的孕妇血浆DNA可用于STR遗传分析。

以往的研究[14，15]只能证实：可以检测到孕妇不具有的、父源性胎儿STR等位基因(Informative STR allele)，但不能得到明确的胎儿STR基因型；胎儿DNA组分占孕妇血浆总DNA的比例少，若检出的STR基因峰值低、又恰好处在母亲的STR等位基因影子带的位置，则难于区分是胎儿的STR基因峰，还是母源性STR等位基因的影子带。因此，根据胎儿游离DNA与母源性DNA分子大小的差异，探索有效方法，从孕妇血浆总DNA中富集胎儿DNA，减少母源性DNA的干扰，可显著提高胎儿特异性的STR或X-STR基因峰的峰高，Li Ying等[16]研究结果可证明这一点。

4 Y染色体特异STR基因座分型

人类Y染色体特异STR基因座(Y-STR)，为人类男性所特有，理论上与正常女性DNA的反应结果为阴性；特别是在女性DNA含量较高的背景下，受女性成分的干扰小，因而在法医DNA物证鉴定及无创伤性产前分子遗传诊断中具有特殊应用价值。邓志辉等[7]采用ReliageneTMY-PLEX 6荧光复合扩增系统中的6个Y-STR基因座，检测53份孕期为11～36孕周的孕妇血浆DNA，结果29例孕男婴的孕妇血浆DNA均检测出清晰的Y-STR等位基因，每例平均检出1.8个基因峰，检出的等位基因与对照组中“丈夫”的Y-STR基因一致。而24例孕女婴的孕妇血浆DNA均未检测出Y-STR特异性等位基因。研究还发现：扩增产物片段较短的基因座，等位基因检出率较高，如DYS393基因座PCR产物大小为113～139 bp，检出率为100%(29/29)；而PCR产物片段较长的基因座，检出率较低，说明了胎儿DNA主要是短片段DNA分子组成；改变PCR反应体系和扩增条件，如增加PCR反应中模板DNA量、增加DNA聚合酶用量、增加PCR循环数、采用二次PCR扩增，均未能提高YSTR等位基因的检出率。

根据胎儿DNA的分子特征，设计PCR引物，进一步缩短Y-STR扩增产物的片段长度，采用扩增产物片段长度在180 bp以下的9个Y-STR基因座组成荧光复合扩增系统，检测30例孕娠男婴、34例孕娠女婴的孕妇血浆DNA[8]，结果孕娠男婴的孕妇血浆DNA，可检出4-9个Y-STR等位基因，平均每例检出7.3个，9个等位基因全部检出的占12/30；大大提高了Y-STR等位基因的检出率[8]。研究表明：Y-STR分型除了可应用于胎儿性别遗传鉴定外，还可获得男性胎儿遗传多态性信息，可应用于孕娠男婴孕妇的无创伤性产前亲子鉴定的排除。

5 非整倍性染色体病

Lo等[17]采用定量PCR技术检测Y染色体特异DNA序列，发现孕妇血浆中21染色体三体综合症(唐氏综合症)胎儿的DNA浓度显著升高(1.97倍以上)；Farina等[18]报道孕妇血浆中唐氏综合症胎儿的DNA平均浓度为对照组的1.7倍；根据孕妇血浆中胎儿DNA浓度增高并结合其它业已建立的血清生化指标，为21三体综合症的筛查提供了可能[9]。研究还发现：孕妇血浆中13三体综合症胎儿DNA浓度显著升高[19]，但18三体综合症胎儿游离DNA的浓度与正常对照组差异不大[19，20]；说明不同的胎盘病理条件下，导致胎儿DNA水平的差异。

6 存在的问题和展望

直接利用孕妇血浆中胎儿游离DNA进行无创伤性产前基因诊断，简便实用，具有广泛的应用前景。业已开展了胎儿性别鉴定、父源性血型基因检测、各类STR遗传标记检测、胎儿非整倍体病的诊断等应用研究，但当前尚难于作为成熟的技术独立应用于临床。

如何避免母源性DNA的干扰，是影响实验成功的关键因素之一。孕妇血浆总DNA，其中大部分为母源性DNA，只有少部分 (约5～7%)为胎儿DNA[2，4]。在以PCR为基础的分子遗传诊断中，混合DNA样本中两种不同DNA组分所占的比例是至关重要的，含量高的模板DNA组分会产生优势扩增，而胎儿DNA含量少(如小于5%)，可能会被漏检。此外，源于胎儿细胞和胎盘细胞经凋亡产生的DNA分子的片段大小，不同于母体血浆DNA分子。母血中胎儿DNA的片段长度要短于母源性DNA，＞99%胎儿 DNA的片段长度在 313bp以下[14，21]。若以100bp SRY序列的相对浓度为100%,则137bp时相对浓度占67%，193bp仅占20%，而313bp时未检出[21]。因此，孕妇血浆中胎儿DNA不仅是浓度和纯度较低，而且主要是短片段DNA分子，这在进行无创性产前分子基因诊断中是不能忽视的。

大规模并行基因组测序技术(massively parallel genomic sequencing)能够检测大量的DNA片段[22]，已应用于唐氏综合症的诊断研究[23，24]。近年来，Lo等[25]直接利用孕妇的血浆DNA进行全基因组测序，获得了完整的胎儿及孕妇的基因组序列，构建了全基因组遗传图谱，为直接利用胎儿游离DNA开展无创伤性产前基因诊断开辟了新途径，具有广泛的应用前景。随着母血中DNA、mRNA等基础研究的深入，以及生物医学技术的进步，无创伤性产前胎儿分子遗传诊断将不断取得新的突破，从而对临床和法医DNA物证鉴定等产生深远影响。

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