阿卡波糖含量检测方法的试验分析

尹灵富

（台州市疾病预防控制中心，浙江 台州 318000）

1 实验材料

（1）实验原料：发酵液:阿卡波糖发酵液。

（2）实验试剂：乙睛(色谱纯）、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、纯净水、微孔滤膜、无水乙醇(分析纯)、丙酮(分析纯)、盐酸、氢氧化钠。

（3）实验仪器：高效液相色谱仪、色谱柱、AT-330柱温箱、磁力搅拌器、分析天平。

2 实验方法

（1）HPLC检测阿卡波糖含量方法的确立：①发酵上清液的获得，离心:将发酵液在12000r/min下低温离心10min得发酵上清液。②液相检测条件的确定，文献报道阿卡波糖在UV210nm处有吸收，并参考中国药典阿卡波糖检测条件流动相配比，经过多次实验摸索初步确定的色谱条件如下：色谱柱:氨基柱sgar-D,size4.6X250mm、流动相:乙睛:PBS=70:30、检测波长:210nm、流速:0.8m1/min、进样量:20ul。③阿卡波糖标准品的线性考察。由于需要采用外标法或标准曲线法对阿卡波糖发酵液及其在树脂柱的洗脱液进行含量计算，所以要考察阿卡波糖标准品的线性以便为准确计算含量提供可靠科学依据。标准品配制:用分析天平精确称取一定量的阿卡波糖标准品，用重蒸水配成浓度分别100ug/ml,200ug/ml,300ug/ml、400ug/ml、500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml的溶液。将不同浓度的标准品用0.45urn的水膜过滤后可进行HPLC检测。用上述液相检测条件对不同浓度的标准品进行检测，将浓度对峰面积作标准曲线。④HPLC检测时稀释倍数考察。取发酵上清液1ml用流动相分别稀释成4倍、5倍、6倍、7倍、8倍后，于4000r/min转速下离心10min后，取样品上清液用0.45um的酷膜过滤后即可进行HPLC检测，用500ug/ml的标准品做对照效价计算。

（2）阿卡波糖理化性质的考察。在提取过程中为保证生物效价不降低，对它的标准品和发酵上清液的一些理化性质如溶解性、稳定性及旋光性等进行了考察，为分离纯化提供参考依据。

阿卡波糖标准品：①外观:阿卡波糖标准品为白色粉末；②溶解度:极易溶于水，微溶于95%乙醇，不溶于丙酮、无水乙醇、乙睛。对其在水中的溶解度进行了考察。③稳定性考察。冰箱4℃冷藏，取浓度为500ug/ml阿卡波糖标准品(蒸馏水配制)置于冰箱4℃冷藏室，一个月取一次样品，将样品用0.45um的水膜过滤后进行液相检测，考察效价变化。稳定pH值范围，用0.2%盐酸及0.2%氢氧化钠将蒸馏水pH值分别调成为1.5,3,4.5,6,6.8、8.5,9.5,10.5,11.5的水溶液，用该水溶液分别配制浓度为600ug/ml阿卡波糖标品。对照品是用未调pH蒸馏水配制。配制完在室温27℃放置二小时后取样，将样品用0.45um的水膜过滤后即可进行液相检测，考察效价变化。热稳定性，分别取15ml浓度为800ug/ml阿卡波糖标准品用稀盐酸或稀碱调成pH分别为1.5，4，9，10的溶液。用旋转蒸发仪温度控制在47℃～49℃之间旋转蒸发20min浓缩成体积都为8.5m1，将样品用0.45um的水膜过滤后进行HPLC效价检测。④旋光性，用0.2%盐酸及0.2氢氧化钠将蒸馏水调pH值分别为1.5，3，4.5，6，6.8，8.5，9.5，10.5，11.5的水溶液，用该水溶液配成浓度为3%的阿卡波糖标准品，用未调pH值的蒸馏水配制对照品。配完后在室温27℃放置半小时，取样进行旋光测定。

（3）阿卡波糖发酵上清液。由于在提取过程中需要调节发酵上清液的pH值便于树脂吸附，所以要考察发酵上清液的pH值稳定性。同时在提取后期需要用旋转蒸发仪浓缩洗脱液，这样要考察发酵上清液的热稳定性。并且在保藏方面要考察冰箱冷冻保藏发酵液的稳定性。所以针对上述这三点对其稳定性进行考察。①热稳定性。取发酵上清液各1ml置于离心管中，放于水浴温度分别为30℃、40℃、50℃水浴锅中保温1h，取出后按照2.1的方法进行液相检测。然后取3份发酵上清液各1ml置于离心管中，在水浴47℃下分别放置20min、30min、40min，取出后同样按照2.1的方法进行液相检测。②保藏稳定性，将发酵上清液置于冰箱冷冻层-20℃冷藏，于1个月、2个月、3个月、4个月后取样。取样品后按照2.1的方法进行液相检测。③稳定pH值范围，用0.2%盐酸、0.2%氢氧化钠将发酵上清液pH调成4，5，6，8，9，10后放置2h，然后取样品按照2.1的方法进行HPLC检测，考察效价变化。

3 结语

（1）首先确定了阿卡波糖标准品浓度在100ug/m1～800ug/ml之间线性良好，可以用外标法来计算发酵上清液的效价。其次，确定了HPLC检测阿卡波糖发酵上清液时的稀释倍数为4倍。

（2）考察了阿卡波糖标准品的理化性质，首先是溶解度，在水溶液中溶解度达到714mg/ml时溶液已很粘稠欲接近饱和但仍未饱和。其次是稳定性，第一点是保藏稳定性考察，确定了阿卡波糖标准品在4℃冰箱里保存至四个月时，效价几乎不变。第二点是稳定pH值范围，标准品在pH值5.5～6.8的水溶液中比较稳定。第三点是热稳定性考察，阿卡波糖标准品在酸性pH<4、碱性pH>9时47℃旋转蒸发不稳定，易分解而导致效价降低，其中酸性条件下比碱性条件下降低得要明显。第四点是旋光性考察，标准品在p H值为1.5时旋光度比其它pH值时都要大，其它pH值的标准品溶液旋光度基本都一致。

（3）考察了阿卡波糖发酵上清液的理化性质，阿卡波糖发酵上清液在40℃时加热一小时活性基本无变化，同时确定在水浴47℃40min邮可卡波糖活性物质基本不会损失。保藏稳定性考察确定在一20℃保藏至3个月时效价基本降低一半。确定了效价稳定的pH值范围在6～7之间。