国外竹类植物组织培养研究最新进展

高志民 刘 青

（国际竹藤中心 国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室北 京 100102）

随着人们对竹类植物开发利用的不断深入，国际上对竹类植物的研究兴趣日趋增强。在过去的10年中，人们对竹类植物的开发利用得到了飞速发展，这主要得益于相关技术的不断完善，其中作为竹类植物快速繁殖的重要手段——组织培养技术也得到了相当程度的发展和完善，已经成为有效的大量获得竹类植物种苗的可行方法，既能快速实现扩繁，又比分株、扦插、埋兜等传统方式大大降低实际成本，对一些重要经济竹种的快速繁殖起到了积极的推动作用。同时，组织培养技术也为竹类植物的种质保存、次生代谢物质的深度开发利用提供了新途径。现对最近10年来国外在竹类植物组织培养方面取得的研究新进展进行概述。

1 基于固体培养基的组织培养

多数成功组织培养繁殖的竹种是以MS为基本培养基，以蔗糖或葡萄糖（浓度25%～30%）为碳源，添加一定浓度的琼脂或卡拉胶（0.5%～0.8%）作为凝固剂，通常pH 5.8～6.5，根据不同的外植体类型以及不同培养阶段添加相应浓度的生长调节物质(2,4-D、6-BA、KT、TDZ、NAA、IAA及IBA等)。培养过程中即便是同一竹种的诱导分化、增殖及生根所需培养基的成分也存在着一定的差异，不同竹种的不同的培养阶段所需培养基成分的差异则更大。因此，目前尚没有一个广谱性的配方适用于不同的竹种。

1.1 茎段侧芽外植体繁殖

近10年来，国外应用组织培养技术对竹类植物进行繁殖研究的竹种涉及丛生竹、散生竹等20多个竹种，其中主要以丛生竹，且多数种类是“以芽繁芽” 为主。不同竹种之间组织培养成功的差异非常大，有的竹种比较容易成功，如以Dendrocalamus hamiltonii的单节枝段为外植体，腋芽在不添加任何生长素的MS培养基上10天就能发芽，芽很容易增殖且形成根茎，丛芽在MS+8 μM BAP + 1 μM NAA的培养基上增殖20倍，丛芽在MS+100 μΜ IBA的培养基中生长10天后转至MS培养基生根率大于90%[1]。而对于一些竹种来说却非常困难，对于大多数散生竹竹种仅仅是处于研究阶段，如对刚竹属的Phyllostachys bambusoides研究表明，以叶鞘为外植体，在添加8.0 mg/L 4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸的MS培养基上诱导出愈伤组织，再将愈伤转到添加不同浓度（0，2%,4% 和 6%）的蔗糖、果糖、葡萄糖的培养基上培养，黄色球形愈伤在以蔗糖为碳源且无光照的条件下能够次生体胚发生，诱导生根，而在光照条件下以葡萄糖为碳源更有效。但愈伤发生和体细胞发生间的竞争决定着叶鞘细胞的分化方向[2]。

以丛生竹的茎段侧芽为外植体，进行组培扩繁成功的竹种较多，如Guadua angustifolia[3]、Dendrocalamus hamiltonii[1]、Bambusa nutans[4]、D.asper、D.giganteus、D.membranaceus、B.tulda、B.bambos、B.multiplex、Melocanna baccifera等竹种[5,6]、D.strictus[7]、B.polymorpha[8]，当然也有少数散生竹竹种，如Phyllostachys pubescens[5]、Phyllostachys edulis[6]。不同竹种所选用的培养基中添加的激素种类和浓度存在着一定的差异，一般是添加生长素（IAA、NAA、IBA、2,4-D等）、细胞分裂素（6-BA、KT、BAP等），或单独使用，或配合使用，以获得最大增殖倍数为目的。如以Bambusa glaucescens带节的茎段为外植体进行腋芽增殖，应用BA和KT都能诱导腋芽增殖，但2者结合的诱导率最高[9]。也有用茎段侧芽长出的新芽，在MS+BA (1.0 mg/L)+2,4-D (1.0 mg/L)培养基上进行诱导胚性愈伤，然后去除2,4-D，在提高BA浓度（2.5 mg/L）的培养基上进行胚诱导，接着在富含蔗糖（8%）但不含生长调节剂的培养基上培养20 天后，胚成熟并产生新芽，转化率为80%，继续培养产生根茎，形成小苗[10]。同样，以Drepanostachyum falcatum腋芽为外植体，通过2,4-D（20μΜ）的诱导在节部和立体叶片基部产生愈伤组织，继而转至含有10μM 2, 4-D + BAP(0.66 ～1.10μM)的培养基上培养产生胚性愈伤，在培养基MS +BAP (5～15 μM)上Coleoptillar stage somatic embryos 发育成生根苗[11]。

生根培养基多在基本培养基中添加一定低浓度的生长素，不同竹种之间生根能力存在较大差异，有的竹种生根比较容易，如来自Bambusa atra成年竹的腋芽在不添加外源生长素的情况下，在丛芽增殖的同时就能生根，而Dendrocalamus giganteus和D.hookeri的丛芽只有在添加IBA的生根培养基中才能生根，同时Dendrocalamus giganteus还需要添加生长素保护剂香豆素[12]。同一竹种的不同株龄茎段，增殖后在同一培养基上诱导生根，其生根率差异显著。对Bambusa vulgaris ‘Striata’竹研究结果表明，应用添加IBA（3 mg/L）的MS培养基，来自1年生枝条腋芽诱导的丛芽生根率为92%，而来自成年竹的诱导率仅为40%。来自Dendrocalamus giganteus幼年竹丛芽的生根率为96.7%，而来自成年竹的丛芽生根率仅为45.6%，但来自成年竹D.hookeri的丛芽生根率则比较高（88.9%）。采用在添加0.5 mg/L TDZ的继代培养基，在连续光照条件下，经过连续3次继代后再进行生根诱导，生根率可达100%[13]。

另外，通过对葡萄糖、蔗糖对生根影响的研究，证明以葡萄糖（88 mM）作为碳源，添加一定浓度的IBA（49.0μM）有助于成熟组织的生根诱导[14]。

1.2 种胚诱导繁殖

由于竹类植物特殊的生殖生物学特性，花和种子不易获得，因此极大限制了竹类植物利用种子的胚诱导繁殖研究。近年来，人们利用一些获得种子相对容易的竹种进行了研究，虽然种子数量不多，但应用组织培养技术，既可先诱导愈伤组织，再诱导芽和根的分化，即器官发生途径；也可以不通过诱导愈伤组织，直接由种胚先形成芽，然后再诱导丛芽，由丛芽直接发育成小植株，实现植株的大规模扩繁。如利用Bambusa ambos var.gigantea颖果胚芽为外植体，将胚轴接种到MS + BAP (2.5～5.0μM), GA3(0.1μM) +NAA(50.0μM) + 5% 蔗糖的培养基上，4周后根茎（鞭）诱导率达到58%～100%，随后在生长素培养基上生根长芽，8周后形成小苗，带根鞭的植株移植到土壤中，实现快速繁殖[15]。

一般情况下，胚起源的愈伤组织容易获得再生植株，如Dendrocalamus hamiltonii通过诱导愈伤组织，再由愈伤诱导出体细胞胚，进而发育成植株，组培苗经过锻炼后移植到田间，表型观察发现通过体细胞发生途径获得的组培苗长势优于以芽繁芽获得的组培苗[16]。

2 基于液体培养基的组织培养

2.1 快速繁殖

与应用固体培养基类似，基于液体培养基的竹类植物组织培养快繁也是在基本的MS培养基中添加适当浓度的生长调节物质，进行诱导、增殖、生根等培养。如以Pseudoxytenanthera stocksii的带芽茎段为外植体，接种在液体MS+NAA 2.68μM+ 6-BA 4.40μM中，光照60 μmol/(m2·s)，光周期12 h、28±1°C 条件下，诱导得到丛生芽，增殖是在液体培养基MS+ NAA(2.68μM)+BA (2.21μM) + ABA (283.93μM)+ 柠檬酸(118.10μM)+半胱氨酸(104.04μM)+ 谷氨酰胺(342.24μM)中进行，每2周继代1次，经过45～50 天的培养，每个侧芽可以获得125～150 个丛芽，3～4个芽一丛在1/2 MS IBA (4.90μM)+BA(0.4 4 μ M)的液体培养基中生根[17]。利用Phyllostachys meyeri种子萌发后，在改良1/2 MS液体培养基中培养，再移植到土壤中，1.5年后茎段又重新灭菌后在1/2 MS液体培养基中培养，实现了有效增殖[18]。

2.2 悬浮培养与种质保护

细胞的悬浮培养既可达到扩繁细胞的目的，又可用来保存种质。在悬浮培养过程中，细胞自身能够产生一定的激素，用UPLC—MS/MS分析了Bambusa balcooa悬浮细胞中细胞分裂素的种类及含量，结果表明用不添加任何细胞分裂素的培养基培养，悬浮细胞中产生的几乎都是类异戊二烯细胞分裂素，唯一检测到的芳香族的细胞分裂素是BA，且含量很低[19]。证明悬浮细胞自身能够产生细胞分裂素，用于维持自身的生长发育，在短期内保持细胞种质的特性。应用改良1/2 MS培养基，添加的3 µM 2,4-D成功实现了Phyllostachys nigra的愈伤组织诱导和细胞悬浮培养[20]。应用液体石蜡对Dendrocalamus hamiltonii的体细胞胚浸埋保存结果表明，经过30, 90, 180, 270和 365 天后，在含有1 mg/L BAP 和 2%蔗糖的MS培养基上体细胞胚的萌发率分别为79.78%，77.49%，71.22%，67.13%和59.99%[21]。这为体细胞发生组织的有效保存提供了一条新的途径。

2.3 次生代谢物质诱导与分离

在竹类植物中含有许多具有开发前景的活性物质，但一般含量很低，直接提取获得率非常低，细胞的悬浮培养给人们带来了新的思路，通过组织培养技术对竹类植物的细胞进行悬浮培养，可以获得优良的细胞悬浮系，大量扩繁后用于活性物质的分离。在添加3 µM 2,4-D的改良1/2 MS培养基上，成功实现了Phyllostachys nigra茎尖愈伤组织的诱导和细胞悬浮培养，通过荧光增白剂28 (Calco fluor White M2R)和苯胺蓝染色，结果显示愈伤葡聚糖出现在纤维细胞壁中，氨基酸分析显示谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸是愈伤组织中的主要氨基酸，天门冬酰胺和酪氨酸则在新生芽中大量存在[20]。从Bambusa edulis的悬浮细胞中分离获得了碱性蔗糖酶（IT Ⅰ）和酸性蔗糖酶（ITⅡ），2者对蔗糖、棉籽糖具有β-呋喃果糖苷酶生物活性，对麦芽糖没有活性[22]。因此，针对具有开发前景的目标活性物质，选择适宜的竹种建立细胞悬浮系，对于开发特殊活性的新产品具有广阔的前景。

3 讨论

3.1 外植体的选择与消毒

具有再生活力的无菌外植体是组织培养成功与否的关键因素之一，一般宜选择生理年龄相对较小的外植体材料。由于不同外植体对杀菌剂的耐受程度存在差异，因此在消毒过程中杀菌剂及其施用时间不同，一般是以酒精（75%）与升汞（0.05%～0.2%）或次氯酸钠（0.5%～2%）配合使用，根据不同外植体类型采用不同的灭菌时间（或浓度）和次数，其中与升汞的组合灭菌效果取良好，次氯酸钠的效果次之。不同的季节，施用升汞灭菌的浓度存在一定的差异，如Bambusa tulda在秋冬季取外植体，用0.05%～0.1%的升汞进行灭菌即可，而在雨季则需要施用更高浓度（0.1%～0.2%）的升汞进行灭菌[23]。

3.2 组培快繁种苗产权保护

利用组织培养技术进行竹类植物的快速繁殖，能够在相对较短的时间内实现大批量生产，用于生产实践。在知识经济的今天，种苗的产权保护至关重要，国外已经建立起了基于各种分子标记的竹类植物组织培养繁殖个体的鉴定体系，如利用MSAP（Methylation Sensitive AFLP）鉴定Bambusa balcooa的组培苗的表型变化[24]，分别运用RAPD和ALFP技术鉴定Dendrocalamus hamiltonii[1]和Bambusa nutans[25]的组培苗的遗传稳定性等，这对于保障竹类植物组培种苗商业化生产与推广应用具有重要价值和现实意义，也是非常值得我们借鉴的。

3.3 试管开花与转基因育种

多数竹类植物很少开花结实是阻碍其杂交育种工作的重要因素，应用组织培养技术实现人为调控开花进程，对于加速竹类植物的常规育种进程具有重要的指导意义。对Dendrocalamuslatiflorus花序组培产生的绿色和白化苗继续培养，在试管内培养8个月后有44%的植株开花，且表型观察花器官各部分均正常，但产生的花粉败育[26]。这意味着人为调控竹类植物试管开花用于杂交育种尚需深入研究。另外，通过基因工程的技术手段来开展竹类植物的转基因育种，有助于加速育种进程，但需要建立完善的遗传转化体系，组织培养技术将是一个重要的环节。虽然国外已有转化D.hamiltonii的研究，并获得转GUS报告基因和tlp基因的转化子[5]，但要获得真正实质性的转基因竹子还有待时日。

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