紫花苜蓿γ－生育酚甲基转移酶（γ－TMT）基因的克隆与逆境下的表达分析

贾会丽，王学敏，高洪文，董洁，王运琦，刘建宁，石永红

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原030032；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193）

＊维生素E是一种脂溶性维生素，在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用［1］。有资料研究表明，维生素E对提高动物的免疫力，改善动物肉质，提高动物繁殖性能，缓解动物应激反应等具有良好的效果［2］。在饲料中添加生育酚，能增加肉品质的稳定性［3］，防止肉类腐败、变味、变色，并延长上架时间［4，5］；医学研究证明每天摄入足够的维生素E会降低一些疾病的发生率，如心血管疾病、癌症等，还有利于提高机体的免疫力等［6］。γ－生育酚甲基转移酶（γ－tocopherol methyltransferase）γ－TMT是维生素E合成途径中一种重要的合成酶，催化γ－生育酚向α－生育酚的转化，对于改变维生素E组成有重要作用。在拟南芥（Arabidopsisthaliana）叶片和种子中过量表达γ－TMT基因，使维生素E各成分中α－生育酚含量分别提高到90%和95%以上，维生素E活性提高10倍［7，8］。

维生素E还能参与清理植物体内由于逆境胁迫产生的自由基，维持植物体内抗氧化的动态平衡，提高植物的抗逆性［9］。在植物中，α－生育酚定位于质体的内膜、类囊体膜和微粒体膜等膜性结构上，定位和结构上的两亲性特点决定了植物体内维生素E的主要功能与维持光合膜上ROS水平以及减轻膜脂过氧化程度有关［10，11］。据报道，逆境处理下，维生素E生物合成途径中某些关键酶基因的表达会被诱导，且不同的酶基因对不同的胁迫也会出现响应时间以及响应强度的差别［12］。对正常植株进行逆境处理会导致植物体内抗氧化物质的增加，从而提高植株对自由基的清除能力［13］。有研究表明在轮叶党参（Codonopsislanceolatae）中过量表达γ－TMT基因，能提高转基因植株的抗氧化活性，且光合速率也比对照提高48%［14］。目前有关维生素E逆境胁迫方面的研究多集中在生育酚环化酶（tocopherol cyclase）TC、尿黑酸异戊烯基转移酶（homogentisate phytyltransferase）HPT和对羟苯丙酮酸双加氧酶（4－Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase）HPPD，而对γ－TMT的研究多集中在其生育酚合成方面，对其抗逆性的研究很少［15］。

紫花苜蓿（Medicagosativa）是目前全国乃至世界上种植最多的牧草，营养价值很高［16］，不论青饲、放牧或调制干草［17］，适口性均好，且具有抗寒、耐盐碱等优良特性［18，19］。因此，研究紫花苜蓿维生素E的合成途径、克隆相关的酶基因，并通过生物技术方法增强植株的氧化活性、提高维生素E含量，对于提高紫花苜蓿抗逆性，改善其营养品质具有十分重要的意义。本研究从紫花苜蓿中克隆了Ms TMT的全长cDNA序列，对其结构进行分析，并通过模拟不同逆境（NaCl胁迫、PEG胁迫、黑暗胁迫、低温胁迫以及ABA胁迫），对MsTMT基因的抗逆性进行探讨，为进一步研究该基因的抗逆调控机制和紫花苜蓿的生育酚品质改良打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用植物材料紫花苜蓿中苜1号（M.sativacv.Zhongmu No.1）由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源研究室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 RNA提取及cDNA的合成 2011年4月1日将中苜1号种子用氯气消毒24 h后播种于铺有滤纸的培养皿上，置于25℃光照培养箱内发芽，待长出2片子叶后移至营养钵中（蛭石∶珍珠岩＝3∶1），培养4周取其叶片，用Trizol法提取总RNA，参照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）将RNA反转录成cDNA。盐、干旱和ABA处理时，植株分别用300 mmol／L NaCl、15%PEG和0.1 mmol／L ABA处理0，2，4，8，12和24 h；冷处理时，植株在4℃低温下胁迫0，2，4，8，12和24 h；暗处理时，植株于黑暗下胁迫0，12，24，48和72 h，Trizol（Ta KaRa公司）法提取各种处理的幼苗叶片RNA，反转录成cDNA；组织表达特异性分析时，在同一株紫花苜蓿上分别取根、茎、叶、花和荚果组织，Trizol法提取各组织RNA，反转录成cDNA。以上样品保存于－70℃，用于后续Real－time PCR检测。

1.2.2 紫花苜蓿γ－TMT基因保守区克隆 根据GenBank登记注册的已有物种γ－TMT基因cDNA序列，Blast分析后得到其相对保守序列。再以蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）γ－TMT基因cDNA 序列为参照，结合NCBI上的Blast结果，用Primer Primer 5.0软件设计保守区特异性引物P1和P2（表1），以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性5 min，94℃30 s，57℃30 s，72℃1 min，共35个循环，反应结束后72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用DNA Gel Extract Kit（Fermentas公司，K0513）回收PCR产物，将回收片段连接PMD－18T载体（Ta KaRa公司，D101A），重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞（天根生化科技有限公司，CB101－01），挑选阳性克隆送至上海英骏生物技术有限公司测序。

表1 试验中所用到的引物序列Table 1 Sequence of primers used in the experiment

1.2.3 紫花苜蓿γ－TMT基因3′末端和5′末端cDNA片段的克隆 根据已获得的紫花苜蓿γ－TMTcDNA保守区序列，设计3′RACE特异性引物P3（表1）和5′RACE特异性引物P4（表1），按照SMARTTMRACE c DNA Amplification Kit（Clontech公司）的方法进行反转录反应和PCR扩增。反应条件如下：94℃预变性3 min；94℃30 s，72℃3 min，5个循环；94℃30 s，70℃30 s，72℃2 min，5个循环；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25个循环；反应结束后72℃延伸5 min。将扩增产物测序，进行序列拼接，得到紫花苜蓿γ－TMT基因的全长序列。用DNAMAN 6.0软件预测其可能的开放阅读框（ORF），设计合成1对cDNA全长引物P5、P6（表1），进行PCR扩增，将扩增产物测序后得到紫花苜蓿γ－TMT基因ORF序列。

1.2.4 Real－time PCR检测紫花苜蓿γ－TMT基因组织及逆境胁迫表达特异性 参照SYBR Premix Ex Taq（Ta KaRa公司，DRR041A）的引物设计原则，根据得到的紫花苜蓿ORF序列设计Real－time PCR特异性引物P7、P8（表1），预计片段大小为151 bp。选择Actin基因为内参基因，用7500荧光定量PCR仪（ABI公司）进行PCR扩增，每个反应重复3次，采用2步法，条件如下：第1步，95℃预变性2 min，第2步，95℃5 s，60℃34 s，40个循环。反应结束后，根据得到的周期阈值（cycle threshold），利用2－△△Ct方法［20］，分别计算紫花苜蓿γ－TMT基因在根、茎、叶、花、荚果中的表达量以及各逆境胁迫下的表达量。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿γ－TMT基因的克隆

根据NCBI上的Blast结果，用Primer Primer 5.0软件设计特异引物P1、P2，以紫花苜蓿cDNA为模板，扩增得到404 bp的目的片段（图1）。经Blast比对分析，发现此片段与已报道的γ－TMT基因有较高的相似性，其中与截形苜蓿的γ－TMT基因cDNA序列同源性最高，为97%，初步确定获得的cDNA片段是紫花苜蓿γ－TMT基因的部分片段。

根据得到的保守区序列设计3′、5′RACE特异性引物，采用RACE技术结合PCR的方法，扩增出γ－TMT基因的3′RACE和5′RACE末端序列，测序结果显示3′和5′端的片段长度分别为660和743 bp（图2）。用DNAMAN 6.0软件进行拼接，得到总长度为1 306 bp的全长c DNA序列。以紫花苜蓿cDNA为模板，用引物P5、P6扩增得到939 bp的开放阅读框（ORF）（图3），该ORF序列与拼接获得的ORF序列完全一致。

图1 紫花苜蓿γ－TMT基因保守区扩增结果Fig.1 Electrophoresis result of conservative fragment

图2 紫花苜蓿γ－TMT基因3′RACE和5′RACE电泳结果Fig.2 Electrophoresis result of the 3′RACE and 5′RACE fragments

2.2 紫花苜蓿γ－TMT基因的生物信息学分析

利用DNAStar软件对紫花苜蓿γ－TMT基因cDNA序列进行分析，该基因全长1 306 bp，包含有一个939 bp完整的开放阅读框，编码312个氨基酸，命名为Ms TMT。氨基酸序列分析表明，Ms TMT基因编码蛋白分子质量约为34.5 k Da，理论等电点PI为5.62。总共包括4 842个原子。在组成该酶的20种氨基酸中，碱性氨基酸（K、R）34个，酸性氨基酸（D、E）40个，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）118个，极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）66个。

通过在线软件http：／／prosite.expasy.org／cgi－bin／prosite／对Ms TMT进行功能位点预测，发现该基因有1个腺苷脱氨基酶信号（［SA］－［LIVM］－［NGS］－［STA］－D－D－P）。利用NCBI的Blast P在蛋白保守区数据库对Ms TMT进行蛋白保守区预测，结果显示Ms TMT属于甲基转移酶家族（Ado Met－MTases）（图4）。该蛋白还包含有2个S－腺苷甲硫氨酸的结合结构域（XXDXGCGIG，VXXPGGXXIX）（图5），与大豆（Glycinemax）、陆地棉（Gossypiumhirsutum）等其他物种的γ－TMT结构相似［6，21，22］，表明该基因确实是紫花苜蓿γ－TMT基因。

从GenBank中下载其他1 3种植物γ－TMT蛋白序列，涉及到豆科、禾本科、十字花科、茄科等多个物种。用MEGA 4.0软件构建系统进化树，分析结果显示，不同来源的γ－TMT基因聚为3类。紫花苜蓿γ－TMT与豆科植物蒺藜苜蓿γ－TMT亲缘关系最近，其次是大豆（图6）。用DNAMAN 6.0软件对紫花苜蓿γ－TMT蛋白与大豆、蒺藜苜蓿、水稻（Oryzasativa）、拟南芥等13种植物中的γ－TMT蛋白同源性进行比较，结果显示与上述几种模式植物的同源性分别为58.19%，54.87%，51.07%和50.12%。γ－TMT蛋白在序列上的差异主要体现在蛋白质的N端，中部的功能区则比较保守。说明虽然不同生物之间的γ－TMT序列同源性有一定差异，却具有功能上的保守性，推测有可能形成类似的蛋白质三维结构。

图3 紫花苜蓿γ－TMT基因ORF扩增结果Fig.3 Electrophoresis result of the ORF

2.3 MsTMT基因在不同组织的表达特异性

在同一株紫花苜蓿上分别取根、茎、叶、花以及荚果，Real－time PCR分析各组织的相对表达量，结果表明，以花中Ms TMT基因的表达量为对照，叶片中表达量最高，为对照的218倍，且明显高于其他组织，茎中表达量次之，为对照的44倍，根中表达量为对照的12.8倍，荚果中表达量为对照的11.8倍（图7）。说明该基因在紫花苜蓿各个器官中均有表达，且在含有光合器官的绿色组织中表达量最高。一般认为植物细胞中α－生育酚的合成部位在绿色植物细胞所特有的质体中［23］。叶绿体含有叶绿素，是重要的质体，主要存在于植物体绿色部分的薄壁组织细胞中，是绿色植物进行光合作用的场所。实验结果说明该基因的表达与质体的分布有很强的相关性。

图4 MsTMT蛋白序列Blast分析Fig.4 The Blast analysis result of MsTMT protein

2.4 不同逆境胁迫处理下Ms TMT基因表达分析

2.4.1 盐胁迫下Ms TMT基因表达特性 以处理0 h为对照，分析NaCl处理不同时间Ms TMT基因的表达差异。结果表明，MsTMT基因受NaCl诱导表达上调，胁迫处理2 h后该基因的表达就已经开始上调，至8 h之前表达量上调不明显，仅为对照的2.1～2.4倍，8 h后基因表达量迅速上升，24 h后该基因的表达量达到对照的21.4倍（图8）。

2.4.2 PEG胁迫下Ms TMT基因表达特性 以处理0 h为对照，分析PEG模拟干旱处理不同时间Ms TMT基因的表达差异。结果表明，随PEG诱导时间的变化，MsTMT基因表达呈明显单峰趋势，在4 h表达量最高，为对照的4.3倍（图9）。

2.4.3 黑暗胁迫下Ms TMT基因表达特性 以处理0 h为对照，分析黑暗胁迫不同时间Ms TMT基因的表达差异。结果表明，随胁迫时间的延长，Ms TMT基因的表达量出现先下降后上升趋势。黑暗胁迫24 hMs TMT表达量最低，仅为对照的9%，随后基因的表达量迅速上升，72 h基因的表达量为对照的12.3倍（图10）。

2.4.4 低温胁迫下MsTMT基因表达特性 以处理0 h为对照，分析低温胁迫不同时间MsTMT基因的表达差异。结果表明，低温胁迫后，Ms TMT基因表达量均低于对照（图11）。

图5 MsTMT基因全长核苷酸序列及推测的氨基酸序列Fig.5 Nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of MsTMT gene

2.4.5 ABA胁迫下MsTMT基因表达特性 以处理0 h为对照，分析外源ABA处理不同时间MsTMT基因的表达差异。结果表明，受ABA诱导后该基因的表达量没有明显变化（图12），说明该基因表达不受外源ABA诱导。

3 讨论

本研究得到紫花苜蓿MsTMT基因的全长cDNA序列。对MsTMT氨基酸序列分析后发现该蛋白有一个腺苷脱氨基酶信号（SLSTDDP），属于甲基转移酶家族（Ado Met－MTases），包含有2个保守的S－腺苷甲硫氨酸结合结构域（SAM－domain）XXDXGCGIG、VXXPGGXXIX，这与已知的棉花（Gossypiumspp.）、大豆等的γ－TMT结构特点一致［6，22，23］。

图6 MsTMT蛋白与其他13种γ－TMT蛋白的系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree ofγ－TMT protein and other thirteen proteins

图7 MsTMT基因的组织表达特异性Fig.7 Organ－specific expression pattern of the MsTMT gene

图8 MsTMT基因在NaCl胁迫下的表达模式分析Fig.8 Expression pattern of MsTMT in response to NaCl stress

图9 MsTMT基因在PEG胁迫下的表达模式Fig.9 Expression pattern of MsTMT in response to PEG stress

图10 MsTMT基因在黑暗胁迫下的表达模式Fig.10 Expression pattern of MsTMT in response to dark stress

图11 MsTMT基因在4℃低温胁迫下的表达模式Fig.11 Expression pattern of MsTMT in response to low temperature stress

图12 MsTMT基因在ABA处理下的表达模式Fig.12 Expression pattern of MsTMT in response to ABA treatment

本研究利用Real－time PCR方法检测了MsTMT基因在紫花苜蓿中的组织表达特异性，结果发现MsTMT基因在各器官中均有表达，但各器官的表达峰度不同，叶片中表达量最高。欧阳青等［24］研究了Bo TMT在结球甘蓝（Brassicaoleraceavar.capitata）不同器官中的表达特征，结果发现Bo TMT在结球甘蓝的各器官中均有表达，但在花和叶片中的表达量明显高于根、茎和种子。一般认为植物细胞中α－生育酚的生物合成部位是质体，主要存在于植物体绿色部分的薄壁组织细胞中，是绿色植物进行光合作用的主要场所。在植物的有色组织（如绿色的叶片）中，α－生育酚是含量最高的生育酚类型，而在非绿色组织（如根、种子）中，α－生育酚含量很低，绝大部分为其生物合成前体γ－生育酚［25］。γ－TMT的作用是催化γ－生育酚转化为α－生育酚，有研究表明在γ－TMT缺失的突变型拟南芥叶片中，γ－生育酚含量显著提高，而α－生育酚消失，重新导入γ－TMT后，叶片又可合成α－生育酚［21］。本实验结果表明MsTMT基因的表达与质体的分布有很强的相关性。

维生素E中由于有酚基的存在，使其具有较强的抗氧化作用，可以保护蛋白质不受到光合损伤，避免膜结构发生脂类过氧化。当植物受到诸如强光、干旱、高盐和极端温度等逆境胁迫后，体内的活性氧（ROS）会增加，ROS的积累会诱导抗氧化物质相关基因的表达。对正常植株进行逆境处理，会导致植物体内抗氧化物质的增加，从而提高植株对自由基的清除能力［12，13］。据报道，在逆境胁迫下，维生素E生物合成途径中的某些关键酶基因的表达会被诱导，如经由强光处理，拟南芥hppd和hpt均会出现表达上调，而tc突变株并没有出现上调，γ－TMT基因表达量几乎没有变化［12］。Abbasi等［26］通过RNAi干扰技术分别构建了抑制烟草（Nicotianatabacum）hpt和γ－TMT基因表达的株系，分别用NaCl和山梨醇模拟盐胁迫和渗透胁迫逆境，研究转基因烟草对逆境处理的耐受性，结果表明，hpt基因被抑制的株系对2种逆境的耐受性明显下降，但是γ－TMT基因被抑制的株系会增强对山梨醇渗透逆境的抗性，却缺乏了对盐的耐受性。说明生育酚的总量及组成不同所产生的抗逆性及抗逆机理也不尽相同。本研究通过模拟不同逆境（NaCl胁迫、PEG胁迫、黑暗胁迫、低温胁迫以及ABA胁迫），对MsTMT基因的抗逆性进行探讨。发现Ms TMT基因受NaCl胁迫、PEG胁迫以及黑暗胁迫表达量上调，但各胁迫下MsTMT基因表达上调趋势不同，这可能是由这3种逆境的不同胁迫机制所造成。

光合激素，如甲基茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA），同样可以影响维生素E的生物合成。维生素E合成途径相关的基因，如hppd，启动子区具有ABA反应元件。逆境诱导JA积累能够抑制光合作用，但活化了抗氧化物质合成的基因。有研究报道在抗旱植物中，内源SA与α－生育酚含量之间存在着相关性。抗氧化物质（维生素E）的水平，体现了植物对外界环境和内环境的应激能力［14］。说明维生素E既可以起到抗氧化作用，也可以作为一种信号，传递氧化还原的状态。本研究对紫花苜蓿进行外源ABA处理后，发现外源ABA基本不影响该基因的表达，这可能与Ms TMT启动子区域的响应元件有一定关系。或许其他光合激素如JA、SA会对MsTMT的表达产生影响，还需要进一步的证实。

γ－TMT是维生素E合成途径中最后一步的关键酶，催化γ－生育酚向α－生育酚的转化，对于改变维生素E组成有重要作用。通过过量表达γ－TMT基因来提高植物体内α－生育酚的比例已经涉及到多个物种［11，27］，但在栽培利用面积最广泛的紫花苜蓿上的研究几乎没有，且对γ－TMT的研究多集中在其生育酚合成方面，对其抗逆性的研究很少，本试验将继续构建植物增强表达载体，进行Ms TMT基因功能研究，进一步为改善紫花苜蓿的品质和抗性创造条件。

［1］ 潘卫东，李晓峰，陈双燕，等.植物维生素E合成相关酶基因的克隆及其在体内功能研究进展［J］.植物学通报，2006，23（1）：68－77.

［2］ 王改琴，李维，王恬.维生素E对家禽抗氧化、免疫功能和繁殖性能的影响研究进展［J］.家畜生态学报，2009，30（6）：1－5.

［3］ 王军，田玉民，刘璐.维生素E对畜禽肉色稳定性影响的研究进展［J］.安徽农业科学，2008，（33）：14545－14547.

［4］ 胡英考.植物维生素E合成及其生物技术改良［J］.中国生物工程杂志，2004，24（1）：32－35.

［5］ 何河，方热军.日粮中添加维生素E对牛肉品质的影响［J］.饲料博览，2008，（2）：13－16.

［6］ Shintani D，DellaPenna D.Elevating the Vitamin E content of plants through metabolic engineering［J］.Science，1998，282（11）：2098－2100.

［7］ Cho E A，Lee C A，Kim Y S，etal.Expression of gamma－tocopherol methyltransferase transgene improves tocopherol composition in lettuce（LatucasativaL.）［J］.Molecules and Cells，2005，19（1）：16－22.

［8］ Van Eenennaam A L，Lincoln K，Durrett T P，etal.Engineering vitamin E content：fromArabidopsismutant to soy oil［J］.The Plant Cell，2003，15（12）：3007－3019.

［9］ 张一弓，张丽静，傅华.植物维生素E合成酶基因克隆及其逆境生理研究进展［J］.草业学报，2009，18（5）：235－242.

［10］ Munné－Bosch S.The role ofα－tocopherol in plant stress tolerance［J］.Journal of Plant Physiology，2005，162（7）：743－748.

［11］ Vidi P A，Kanwischer M，Baginsky S，etal.Tocopherol cyclase（VTE1）localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles［J］.The Journal of Biological Chemistry，2006，281（16）：11225－11234.

［12］ Collakova E，DellaPenna D.The role of homogentisate phytyltransferase and other tocopherol pathway enzymes in the regulation of tocopherol synthesis during abiotic stress［J］.Plant physiology，2003，133（10）：930－940.

［13］ Noctor G，Foyer C H.Ascorbate and glutathione：keeping active oxygen under control［J］.Plant Biology，1998，49（6）：249－279.

［14］ Ghimire B K，Seong E S，Goh E J，etal.Improving antioxidant activity in transgenicCodonopsislanceolataplants via overexpression of theγ－tocopherol methyltransferase（γ－TMT）gene［J］.Plant Growth Regulation，2011，63（1）：1－6.

［15］ 李殷.植物维生素E生物合成途径及调控［D］.上海：复旦大学，2009.

［16］ 张冬玲，刘建宁，王运琦，等.山西省中部地区紫花苜蓿引种试验［J］.中国草食动物，2010，30（5）：43－46.

［17］ 夏银素，王成章，詹发柏，等.苜蓿草粉饲粮添加纤维素酶对蛋鸡生产性能、蛋品质及养分利用率的影响［J］.草业学报，2011，20（5）：183－191.

［18］ 李源，刘贵波，高洪文，等.紫花苜蓿种质耐盐性综合评价及盐胁迫下的生理反应［J］.草业学报，2010，19（4）：79－86.

［19］ 姜健，杨宝灵，夏彤，等.紫花苜蓿耐盐种质资源的遗传多样性分析［J］.草业学报，2011，20（1）：119－125.

［20］ Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2－△△CTmethod［J］.Methods，2001，25（4）：402－408.

［21］ Bergmüller E，Porfirova S，Drmann P.Characterization of anArabidopsismutant deficient inγ－tocopherol methyltransferase［J］.Plant Molecular Biology，2003，52（8）：1181－1190.

［22］ 胡英考，孟宪萍，李雅轩，等.大豆γ－生育酚甲基转移酶基因的克隆与表达分析［J］.大豆科学，2011，30（2）：198－204.

［23］ 邹礼平，高和平.棉花γ－生育酚甲基转移酶基因全长cDNA的克隆与序列分析［J］.江苏农业学报，2009，25（3）：490－493.

［24］ 欧阳青，樊春涛，孙卉，等.结球甘蓝γ－生育酚甲基转移酶cDNA的克隆、分析及其异源表达酶蛋白的功能研究［J］.自然科学进展，2003，13（7）：709－715.

［25］ Grusak M A.Improving the nutrient composition of plants to enhance human nutrition and health［J］.Plant Biology，1999，50（6）：133－161.

［26］ Abbasi A R，Hajirezaei M，Hofius D，etal．Specific roles ofα－andγ－tocopherol in abiotic stress responses of transgenic tobacco［J］．Plant physiology，2007，143（4）：1720－1738．

［27］ Lee B K，Kim S L，Kim K H，etal．Seed specific expression of perillaγ－tocopherol methyltransferase gene increases a－tocopherol content in transgenic perilla（Perillafrutescens）［J］．Plant Cell Tissue and Organ Culture，2008，92（1）：47－54．