羊草DREB转录因子的系统发育和功能研究

马兴勇，彭献军，苏蔓，张乐新，周庆源，陈双燕，程丽琴＊，刘公社＊

（1.中国科学院植物研究所资源植物研发重点实验室，北京100093；2.中国科学院研究生院，北京100049）

＊干旱、高盐和低温等非生物胁迫影响植物的生长发育，植物中相应发生一系列分子水平的变化来适应胁迫［1］。转录因子调控逆境相关基因在特异时空内表达，是植物响应逆境的一个重要组成部分［2］。DREB（dehydration responsive element binding proteins）是植物中已知的与非生物胁迫相关的最重要的转录因子基因之一［1］。DREB转录因子分为DREB1和DREB2两类，分别在植物响应低温胁迫和渗透胁迫的过程中起作用［3］。DREB转录因子通过与启动子上的DRE／CRT元件结合，激活下游一系列与非生物胁迫相关基因的表达［1］。基因芯片分析表明，两类DREB转录因子的下游基因有重叠的部分但并不完全相同［4］。DREB2类转录因子除了响应渗透胁迫外，也响应高温胁迫。另外，有些DREB转录因子基因的表达受放牧［5］或创伤的诱导［6］。拟南芥（Arabidopsisthaliana）［3］、水稻（Oryzasativa）［7］和玉米（Zeamays）［8］等植物中克隆到的 DREB转录因子，已被证明可以用来提高植物的抗逆能力。许多研究者已经将该类基因转化到各种草坪草及牧草之中，并成功获得了综合抗性增强的转基因植株［9］。

羊草（Leymuschinensis）隶属禾本科（Gramineae）赖草属，在我国东北和内蒙古有广泛分布［10］。羊草兼具重要的经济价值和生态价值，是一种非常重要的乡土草。羊草具有发达的根茎，可以通过根茎进行无性繁殖［11］。羊草具有耐寒和耐盐碱的特点，对NaCl、Na2CO3处理的最高耐受浓度可分别达到600和175 mmol／L［12］。虽然羊草具有很好的抗逆能力，但是关于其抗逆分子机理的研究较少。目前，羊草中仅有几丁质酶ClassⅡ、乙醛脱氢酶、光系统Ⅱ外周蛋白和V－ATPase等少数基因被克隆［13－17］。作者所在的实验室也成功地克隆并鉴定了羊草中的1个DREB转录因子基因［5］。目前羊草的基因组信息相对较少，这限制了羊草抗逆分子机理的研究和相关基因的克隆。通过构建c DNA文库并对部分cDNA克隆测序来获得ESTs，是获得基因组信息的有效方法［18］。Jin等［19］构建了碱性环境胁迫下羊草叶和根的cDNA文库，并测序得到了1 228条ESTs。王丽娟等［20］通过构建羊草叶片c DNA文库并测序得到了285条ESTs。然而，通过这种方法获得的ESTs数量仍然是有限的。目前，GenBank的核酸数据库（nucleotide database）中仅有羊草序列72条，EST数据库（dbEST）中仅有羊草序列1 692条，2个数据库共有2条DREB序列。DREB转录因子属于ERF家族中的DREB亚家族，在拟南芥基因组中该亚家族有57个成员。据此，羊草DREB亚家族基因序列尚有潜力可挖。作者所在实验室对羊草转录组进行了高通量测序，获得了大量EST。本研究通过构建系统发育树，对EST数据中的DREB转录因子基因进行系统挖掘，并选择其中的Lc DREB21基因进行功能验证。

1 材料与方法

1.1 材料

羊草和拟南芥，2010年种植于中国科学院植物研究所培养室，恒温23℃，16 h光照，8 h黑暗。

1.2 方法

1.2.1 高通量测序 羊草种植在塑料钵中，8周大的幼苗（4叶期）用于实验。幼苗经低温和干旱处理，取样，混合后提取RNA。经反转录，建库，使用454 GS FLX进行测序（测序工作由中国科学院国家基因研究中心完成）。测序数据通过GoPipe进行GO（gene ontology）分析，通过NCBI的blast进行核酸和蛋白的同源性分析，通过与CDD数据库比对进行KOG（clusters of eukaryotic orthologous groups）分析。

1.2.2 RACE 羊草幼苗经400 mmol／L NaCl处理，提取总RNA，经反转录的cDNA第一链为模板。采用Clontech公司的RACE试剂盒。Lc DREB21基因引物和UPM引物序列分别为：5′－TGAAGTTATCCCTATTGCTCCGCATGAC－3′；5′－CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT－3′。

1.2.3 荧光定量PCR 对于盐胁迫，将羊草幼苗根部浸入400 mmol／L NaCl溶液，干旱胁迫用20%PEG6000模拟，ABA处理使用浓度为100μmol／L，低温处理将羊草苗放进4℃冰箱。4种处理后，分别在0，1，3，8，12和24 h时取材，提取RNA。经DNase I消化的RNA反转录成cDNA，使用两步法进行荧光定量PCR。基因特异引物：5′－TAAACCCGTCATCGCCATCT－3′，5′－CCTGGAAGTATCCCAACCAAA－3′；内参（actin）引物：5′－CTGTTCTTGGCAGTCTCCAGCTC－3′，5′－GTGCTTTCCCTCTATGCAAGTGGT－3′。

1.2.4 酵母单杂交Lc DREB21基因经Sal I和Pst I酶切后，连接到酵母表达载体p Bridge的Sal I和Pst I酶切位点间，得到重组载体pBridge－BD－Lc DREB21。重组载体pBridge－BD－Lc DREB21转化含有His3和LacZ报道基因的酵母AH109株系。用pBridge空载体转化酵母AH109株系作为负对照，用转有BD－Lc DREB3a的AH109株系作为阳性对照。转化方法参照Clontech试剂盒的酵母转化方法。将上述3个转化酵母菌株在不含His和Trp的SD培养基上进行划线培养。培养3 d的酵母用于含有X－gal的Z－buffer显色。

1.2.5 拟南芥转化及筛选 利用pCAMBIA1302的NcoI和SpeI位点，构建了pCAMBIA1302－35S：：LcDREB21－GFP。将构建的载体转化农杆菌EHA105，用花序侵染法转化拟南芥［21］。使用含25 mg／L潮霉素的MS培养基，筛选得到35S：：Lc DREB21－GFP阳性拟南芥株系。

1.2.6 荧光观察 取在筛选培养基上生长4 d的35S：：Lc DREB21－GFP T1代阳性植株，压片，使用ZEISS LSM 510 META激光共聚焦显微镜观察。

1.2.7 系统发育树构建 通过blast分析，筛选羊草转录组测序数据中的ERF家族基因，结合拟南芥ERF家族基因的蛋白序列构建了邻接树（neighbor－joining tree）。参考已有的研究，鉴定了羊草DREB转录因子基因所在的分支。利用羊草和拟南芥中DREB转录因子蛋白序列再次构建邻接树。序列比对使用MUSCLE［22］，比对后的序列用Bio Edit进行编辑［23］。使用MEGA5构建邻接树，设置bootstrap重复次数为1 000［24］。

2 结果与分析

2.1 羊草DREB转录因子的系统发育研究

通过Roche 454测序技术，作者所在实验室对羊草转录组进行了测序。经过对测序数据分析，得到属于羊草DREB转录因子亚家族的EST 26条。采用邻接法，利用羊草EST和拟南芥基因组中的DREB亚家族基因的蛋白序列，构建了系统发育树。参照已有的研究，将羊草DREB亚家族EST分为4个类群［25］（图1）。羊草DREB转录因子在4个类群有较均匀地分布，这说明DREB转录因子亚家族在羊草和拟南芥基因组中是保守的。同时也表明，本测序数据覆盖度好，拼接准确。在构建的系统发育树中，DREB1／CBF类转录因子位于第3类群，DREB2类转录因子位于第4类群。DREB1／CBF类转录因子和DREB2类转录因子分别在植物耐低温和耐渗透胁迫中起作用。目前，对位于第1类群基因功能的研究较少，第2类群基因的功能还不清楚。

在拟南芥中，DREB2A（At5g05410）基因受干旱和高盐胁迫诱导，过表达后可以提高拟南芥耐干旱和高盐胁迫的能力［26］。在构建的系统发育树中，与At5g50410同源性最高的是Lc DREB21，它们都位于第4类群。通过RACE得到了Lc DREB21的编码区全长，并对其功能进行了深入研究。

图1 羊草和拟南芥DREB转录因子系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of DREB transcription factors in L.chinensis ESTs and A.thaliana genome

2.2 Lc DREB21编码区全长的获得

通过转录组测序，得到的Lc DREB21 EST长度为486 bp。通过NCBI中的blast分析，其与大麦（Hordeum vulgare）和小麦（Triticumaestivum）的DREB基因具有很高同源性，可能包括CDS 3′末端。根据Lc DREB21 3′端序列，设计了5′引物进行RACE，得到了900 bp左右的特异性扩增片段（图2）。PCR产物回收并测序，得到的5′序列与原序列拼接得到总长为949 bp的序列。用DNAMAN软件对得到的序列进行ORF预测，并与大麦同源基因比较，结果表明其具有完整的CDS（GenBank登入号为：JN860437）。LcDREB21编码1个由278个氨基酸残基组成的蛋白。利用NCBI的CDD数据库工具对其进行保守结构域预测，结果显示其第76～139位氨基酸残基构成一个典型的AP2保守结构域。

2.3 Lc DREB21在胁迫条件下的表达模式

对羊草幼苗分别进行PEG、ABA、NaCl和低温处理，在0，1，3，8，12和24 h等6个时间点分别取材，用于荧光定量PCR分析（图3）。结果表明，Lc DREB21表达受PEG、ABA和NaCl的诱导，3种处理下，mRNA的积累量分别在24，12和3 h达到高峰。另外，Lc DREB21的表达基本不受低温诱导。

2.4 Lc DREB21的转录激活功能

一个转录因子起作用需要结合特定的启动子，并激活或抑制下游基因的表达。使用酵母单杂交系统，证明了Lc DREB21具有激活功能。首先，将Lc DREB21克隆到pBridge载体上，并转化酵母AH109。得到的阳性酵母菌株能够在不含His和Trp的SD培养基上生长。而且，阳性菌株在划线培养后，经含有X－gal的Z－buffer显色后变蓝。转BD－Lc DREB3aAH109株系作为阳性对照得到了类似结果［5］。而转有p Bridge空载体的AH109作为阴性对照，不能在缺少His和Trp的SD培养基上生长。以上结果说明，Lc DREB21具有转录激活能力（图4）。然而与对照相比，Lc DREB21的激活能力明显较弱。

图2 LcDREB21的5′RACE扩增结果Fig.2 Amplified results of LcDREB21 by 5′RACE.

图3 胁迫和ABA处理下LcDREB21的表达模式Fig.3 Expression patterns of LcDREB21 in response to various treatments

2.5 Lc DREB21的亚细胞定位

通过潮霉素筛选，得到了T1代转35S：：Lc DREB21－GFP和35S：：GFP的拟南芥阳性苗。转基因拟南芥苗经压片后，在激光共聚焦显微镜下观察。在转35S：：GFP的拟南芥中，绿色荧光在细胞质和细胞核中均有分布。在转35S：：Lc DREB21－GFP的拟南芥中，绿色荧光只分布在细胞核中。以上结果表明，Lc DREB21专一性定位在细胞核中（图5）。

图4 酵母单杂交Fig.4 One hybrid system of yeast

图5 LcDREB21亚细胞定位Fig.5 Subcellular location of LcDREB21

3 讨论

对拟南芥和水稻基因组中DREB的系统发育研究表明，DREB转录因子亚家族的多数类群在2种植物中同时存在，在进化上是保守的［25］。所以新测序物种DREB转录因子的分析，可以参照拟南芥和水稻中的研究，如在小麦［27］和玉米［28］研究中的应用。本研究共得到26条DREB转录因子EST，参照拟南芥中DREB转录因子的系统发育研究，将羊草DREB亚家族EST分为4个类群［25］。其中位于第一和第二类群的共有11条，在拟南芥和水稻中，对DREB亚家族这2个类群中基因的研究较少，它们的功能还不清楚［25］。DREB1类转录因子和DREB2类转录因子分别位于第3和第4类群，Lc DREB21位于第四类群，属于DREB2类转录因子。多数DREB2类转录因子的表达受干旱和高盐胁迫诱导，如AtDREB2A、AtDREB2B和OsDREB2A等［3，7，29］。然而，OsDREB2B和ZmDREB2A的表达响应干旱和高盐胁迫诱导的同时，也受低温胁迫的诱导［8，29］。与多数DREB转录因子类似，Lc DREB21的表达受干旱和高盐胁迫的诱导，基本不受冷诱导。另外，LcDREB21具有转录激活功能和核定位能力。因此，LcDREB21很可能在植物应对干旱和高盐胁迫的过程中起作用。

在拟南芥、水稻和玉米等植物中已克隆得到了多个DREB转录因子基因，然而牧草中的研究还比较少［9］。基因组信息的匮乏，限制了羊草DREB转录因子基因的克隆和功能研究。本研究发掘的26条DREB转录因子EST，丰富了羊草原来仅有2条DREB的核酸和EST数据库，为进一步研究DREB转录因子在植物耐低温和渗透胁迫过程中的作用奠定了基础。另外，有些DREB转录因子的表达受刈割或创伤的诱导，如Peng等［5］报道了Lc DREB3a的表达受刈割的诱导，Hong和Kim［6］报道了Ca DREBLP1的表达受创伤的诱导。对Lc DREB21在刈割下的表达进行了半定量PCR分析，发现其表达量没有明显变化（结果未列出）。因此，羊草DREB家族亚家族基因中有的与创伤或刈割有关，有的未必有关，这方面的研究有助于理解羊草耐牧的分子机理。

基因工程在最近20年取得了迅猛发展，具有在分子水平上定向改造遗传性状的优势，在牧草新品种培育研究中的应用也越来越广［30］。一些基因已被用于基因工程改良羊草，如 Wang等［31］通过组成型表达Ta LEA3基因，提高了羊草的耐旱能力。与单个功能基因相比，通过转化DREB转录因子基因，可以激活下游一系列抗逆相关基因的表达，从而能提高植物的综合抗性。因此，羊草DREB转录因子用于基因工程改良是非常好的选择。

［1］ Yamaguchi－Shinozaki K，Shinozaki K.Transcriptinonal regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses［J］.Annual Review of Plant Biology，2006，57（1）：781－803.

［2］ Rushton P J，Somssich I E.Transcriptional control of plant genes responsive to pathogens［J］.Current Opinion in Plant Biology，1998，1（4）：311－315.

［3］ Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，etal.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP／AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought－and low－temperature－responsive gene expression，respectively，inArabidopsis［J］.The Plant Cell，1998，10（8）：1391－1406.

［4］ Sakuma Y，Maruyama K，Osakabe Y，etal.Functional analysis of an arabidopsis transcription factor，DREB2A，involved in drought－responsive gene expression［J］.The Plant Cell Online，2006，18（5）：1292－1309.

［5］ Peng X J，Ma X Y，Fan W H，etal.Improved drought and salt tolerance ofArabidopsisthalianaby transgenic expression of a novel DREB gene fromLeymuschinensis［J］.Plant Cell Reports，2011，30（8）：1－10.

［6］ Hong J－P，Kim W T.Isolation and functional characterization of theCa－DREBLP1 gene encoding a dehydration－responsive element binding－factor－like protein 1 in hot pepper（CapsicumannuumL.cv.Pukang）［J］.Planta，2005，220（6）：875－888.

［7］ Dubouzet J G，Sakuma Y，Ito Y，etal.OsDREBgenes in rice，OryzasativaL.，encode transcription activators that function in drought－，high－salt－and cold－responsive gene expression［J］.The Plant Journal，2003，33（4）：751－763.

［8］ Qin F，Kakimoto M，Sakuma Y，etal.Regulation and functional analysis ofZm DREB2Ain response to drought and heat stresses inZeamaysL［J］.The Plant Journal，2007，50（1）：54－69.

［9］ 王舟，刘建秀.DREB／CBF类转录因子研究进展及其在草坪草和牧草抗逆基因工程中的应用［J］.草业学报，2011，20（1）：222－236.

［10］ 刘公社，齐冬梅.羊草生物学研究进展［J］.草业学报，2004，13（5）：6－11.

［11］ 李海燕，李建东，徐振国，等.内蒙古图牧吉自然保护区羊草种群营养繁殖特性的比较［J］.草业学报，2011，20（5）：19－25.

［12］ 颜宏，赵伟，尹尚军，等.羊草对不同盐碱胁迫的生理响应［J］.草业学报，2006，15（6）：49－55.

［13］ 金华，安晓雯，姜国斌.羊草ClassⅡ几丁质酶基因的克隆及序列分析［J］.农业科学与技术，2009，10（4）：96－100.

［14］ 金华，王璐，朴永哲，等.羊草OEE1基因的克隆及盐胁迫下的表达［J］.西北植物学报，2011，31（5）：881－885.

［15］ 李蕊沁，冯树丹，于莹，等.羊草几丁质酶ClassⅡ基因的克隆、生物信息学分析及原核表达［J］.中国农业科技导报，2010，12（2）：103－110.

［16］ 李新玲，吴姝菊，王全伟.羊草乙醛脱氢酶基因Lc ALDH的克隆与表达分析［J］.草业学报，2011，20（4）：187－193.

［17］ 吕召志，冯树丹，于莹，等.羊草LVAP1基因的克隆及生物信息学分析［J］.哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2010，26（6）：651－656.

［18］ Adams M，Kelley J，Gocayne J，etal.Complementary DNA sequencing：expressed sequence tags and human genome project［J］.Science，1991，252：1651－1656.

［19］ Jin H，Plaha P，Park J Y，etal.Comparative EST profiles of leaf and root ofLeymuschinensis，a xerophilous grass adapted to high p H sodic soil［J］.Plant Science，2006，170（6）：1081－1086.

［20］ 王丽娟，金治平，王能飞，等.羊草叶片cDNA文库的构建及部分表达序列标签的分析［J］.草业学报，2009，18（1）：65－71.

［21］ Clough S J，Bent A F.Floral dip：a simplified method forAgrobacteriummediated transformation ofArabidopsisthaliana［J］.The Plant Journal，1998，16（6）：735－743.

［22］ Edgar R C.MUSCLE：multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput［J］.Nucleic Acids Research，2004，32（5）：1792－1797.

［23］ Hall T A.BioEdit：a user－friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95／98／NT［C］.Nucleic Acids Symposium Series，1999，41：95－98.

［24］ Tamura K，Peterson D，Peterson N，etal.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731－2739.

［25］ Nakano T，Suzuki K，Fujimura T，etal.Genome－wide analysis of the ERF gene family inArabidopsisand rice［J］.Plant Physiology，2006，140（2）：411－432.

［26］ Sakuma Y，Maruyama K，Osakabe Y，etal.Functional analysis of anArabidopsistranscription factor，DREB2A，involved in drought－responsive gene expression［J］.The Plant Cell，2006，18（5）：1292－1309.

［27］ Zhuang J，Chen J M，Yao Q H，etal.Discovery and expression profile analysis of AP2／ERF family genes fromTriticum aestivum［J］.Molecular Biology Reports，2011，38（2）：745－753.

［28］ Zhuang J，Deng D X，Yao Q H，etal.Discovery，phylogeny and expression patterns of AP2－like genes in maize［J］.Plant Growth Regulation，2010，62（1）：51－58.

［29］ Matsukura S，Mizoi J，Yoshida T，etal.Comprehensive analysis of rice DREB2－type genes that encode transcription factors involved in the expression of abiotic stress－responsive genes［J］.Molecular Genetics and Genomics，2010，283（2）：185－196.

［30］ 马江涛，王宗礼，黄东光，等.基因工程在牧草培育中的应用［J］.草业学报，2010，19（6）：248－262.

［31］ Wang L，Li X，Chen S，etal.Enhanced drought tolerance in transgenicLeymuschinensisplants with constitutively expressed wheatTa LEA3［J］.Biotechnology Letters，2009，31（2）：313－319.