芥菜籽抑制Ⅰ型超敏反应的实验研究

汶春苗，杨闰平，梅宁菊，董 亚，李恒进，赵 华

1解放军总医院 皮肤科，北京 100853；2西宁市第一人民医院 皮肤科，西宁 810000；3涿州市医院皮肤科，涿州 072750

I型超敏反应又称过敏反应或速发型超敏反应，主要由特异性IgE抗体介导，可发生于局部或全身，是临床最常见的一种超敏反应，其发病率呈逐年上升趋势。芥菜籽(mustard seed，MS)又名芥子，是十字花科芸苔属植物芥菜的种子，其种类有黑芥籽、黄芥籽和白芥籽。《中国药典》记载：芥菜籽具有温肺豁痰利气，散结通络止痛的功效，用于寒痰喘咳，胸胁胀满，痰滞经络关节麻木，疼痛，痰湿流注，阴疽肿毒等症[1]。目前研究证明芥菜籽具有抗菌、抗辐射、抑制前列腺增生、防癌抗癌、抗炎镇痛等作用[2-7]。笔者之前的研究发现，芥菜籽能够抑制小鼠Ⅳ型超敏反应(文章待发)，但是否对Ⅰ型超敏反应有影响尚不清楚。本研究通过组胺、卵白蛋白(ovalbumin)等诱发小鼠I型超敏反应模型，探讨芥菜籽对I型超敏反应的作用。

材料和方法

1 实验动物 雌性Balb/c小鼠58只，5周龄，15-17g，SPF级(购自北京维通利华公司，合格证号：SCXK京2009-0007)。随机分为模型组(26只)、5%芥菜籽组(26只)，正常组(6只)。模型组和正常组给予普通饲料、芥菜籽组给予含5%芥菜籽饲料，喂养3周后，再进行实验。饲养环境：动物房保持通风、干燥，室温22-25℃，湿度50%-70%，自由饮水和饮食。

2 试剂与仪器 5%芥菜籽饲料(南方医科大学实验动物中心提供)；0.1%组胺溶液(由阿罗格公司提供)，Compound 48/80(SIGMA公司，产品批号：040M4047)，伊文思蓝(SIGMA公司，产品批号：MKBD9146V)，丙酮(国药集团化学试剂公司，产品批号：20081108)。卵白蛋白(SIGMA公司，产品批号：040M7001V)，氢氧化铝(国药集团化学试剂公司，产品批号：20090327)，IL-4、IgE、IFN-γELISA试剂盒(北京嘉美生物公司)。721B型分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)，0.8cm打孔器，低温高速离心机(德国HERAEUS生产)，酶标仪(SIGMA公司)，DK-8AD型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)。

3 小鼠毛细血管通透性增高模型制备 1)用组胺建模：喂养3周后，取模型组和芥菜籽组小鼠各10只。按照参考文献[8]所述方法并加以改进，实验前1天，各组小鼠背部剃毛4cm×4cm。实验当天，于脱毛处皮内注射0.1%组胺溶液0.05ml/只，形成一小皮丘，同时立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝溶液(0.05ml/10g)，30min后脱颈处死小鼠，迅速翻转背部皮肤，测量蓝斑的最长径(D)及中点垂直径(d)，剪下蓝斑皮肤，用直径0.8cm打孔器打下1块皮片，剪碎后置于4ml丙酮-0.9%氯化钠注射液(7∶3)溶液中，在37℃恒温水浴锅中浸泡24h后，以3 000r/min离心，取上清液于721B型分光光度计波长610nm处测光密度(OD值)，参考文献[9]所述，按以下公式计算蓝斑面积：S=3×[(D+d)/4]2，D=蓝斑最长径，d=中点垂直径。2)用Compound 48/80建模：喂养3周后，取模型组和芥菜籽组小鼠各10只。按照参考文献[10]所述方法，Compound 48/80用蒸馏水稀释后皮内注射于小鼠背部脱毛处(0.5μg/20μl)，其余方法同上。

4 小鼠全身Ⅰ型超敏反应模型制备 按照参考文献[11]所述方法，具体分组如下：1)模型组(6只)：以0.9%氯化钠注射液配制氢氧化铝混悬液(1g/L)，每只腹腔注射0.2ml的卵白蛋白(OVA 0.1mg)与AL(OH)3溶液(1g/L)的混合液进行初次免疫，第10天重复1次；2)芥菜籽组(6只)：处理同上；3)正常组(6只)：不予任何处理。第14天摘眼球取血，放置4℃冰箱，24h后在4℃下离心5min，12 000r/min，分离血清，-20℃冻存备用。ELISA检测严格按照IgE，IL-4和IFN-γELISA试剂盒操作说明进行。

5 统计学方法 用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。所测数据结果以±s表示。组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠毛细血管通透性比较 小鼠尾静脉注射伊文思蓝后，背部被动致敏部位的皮肤明显蓝染，而未致敏部位的皮肤颜色正常。模型组小鼠的蓝斑面积较大，芥菜籽组的蓝斑面积相对较小(P<0.05)。两组所测的蓝斑OD值有统计学差异(P<0.05)。见表1。

2 芥菜籽对小鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ的影响 ELISA血清结果显示模型组的IgE、IL-4水平相比正常组都有明显升高(P<0.01)，但与芥菜籽组之间差异无统计学意义(P>0.05)。模型组的IFN-γ水平相比正常组明显降低(P<0.01)，但与芥菜籽组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 芥菜籽对组胺及compound 48/80致小鼠毛细血管通透性增高的影响Tab 1 Effect of mustard seeds on histamine and compound 48/80-induced capillary permeability in mice (±s, cm2)

表1 芥菜籽对组胺及compound 48/80致小鼠毛细血管通透性增高的影响Tab 1 Effect of mustard seeds on histamine and compound 48/80-induced capillary permeability in mice (±s, cm2)

aP<0.05, vs model group

ceruleus OD Area of Locusceruleus OD Model 3.290±0.462 0.187±0.04 1.388±0.351 0.190±0.038 MS 2.521±0.314a0.137±0.06a 0.763±0.381a0.128±0.036a Group (n=10) Histamine Compound 48/80 Area of Locus

表2 芥菜籽对小鼠全身Ⅰ型超敏反应血清细胞因子的影响Tab 2 Effect of mustard seeds on serum IgE, IL-4 and IFN-γ levels in mice with systemic typeⅠhypersensitivity (±s, pg/ml)

表2 芥菜籽对小鼠全身Ⅰ型超敏反应血清细胞因子的影响Tab 2 Effect of mustard seeds on serum IgE, IL-4 and IFN-γ levels in mice with systemic typeⅠhypersensitivity (±s, pg/ml)

aP<0.05, vs normal group; bP>0.05, vs model group

MS 7.133±1.112b 2.40±0.61b 2.56±0.45b Model 8.048±0.941a 2.98±0.58a 2.01±0.74a Normal 2.585±0.594 0.81±0.31 5.93±0.99

讨 论

荨麻疹、血管神经性水肿等皮肤黏膜过敏性疾病是皮肤科常见的Ⅰ型超敏反应，其主要发病机制是由特异性IgE抗体介导，肥大细胞、嗜碱粒细胞和嗜酸粒细胞等效应细胞以释放生物活性介质的方式参与发生[12]，其中组胺、5-羟色胺、白三烯等作为细胞颗粒内预先储备的介质和脱颗粒过程中新合成的介质被释放出来后具有多种生物活性。组胺可使毛细血管扩张、平滑肌收缩、腺体分泌增加。Compound 48/80作为一常用的肥大细胞介质释放剂，通过增加GTPγS结合G蛋白的几率激活肥大细胞的分泌过程[13]，最终引起组胺、5-羟色胺等介质释放，从而引起过敏反应。本实验结果显示，模型组和芥菜籽的蓝斑面积和吸光度都有差别，模型组显著大于芥菜籽组，说明芥菜籽可以抑制局部的超敏反应。

正常情况下血清中总IgE抗体含量很低，而发生Ⅰ型超敏反应时，IgE抗体含量则显著增高，故在该类疾病治疗中，主要以抑制IgE产生为目的[14]。目前的研究认为Thl/Th2细胞亚群失衡在Ⅰ型超敏反应的发生与发展中起重要作用，即Th2细胞优势免疫模式。IFN-γ和IL-4分别是Thl和Th2代表性的细胞因子。Th1和Th2细胞均能调控IgE的合成，二者失衡导致IgE产生失控而增多，与Ⅰ型超敏反应的发生密切相关。本研究中，通过ELISA法测外周血中的IgE、IFN-γ和IL-4，发现模型组和正常组间差异有统计学意义，符合Ⅰ型超敏反应疾病的血清学变化趋势。但模型组和芥菜籽组间的差异无统计学意义，可能与研究样本量少，无法正确反应血清学的变化趋势有关；另外也可能是芥菜籽不能通过影响细胞因子来抑制过敏反应。

本实验研究发现芥菜籽能够抑制皮肤局部的超敏反应，这一点与李小莉的研究结果一致[6]，但对全身超敏反应无明显影响。

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