杜仲活性成分的提取及分离纯化方法研究进展

潘亚磊，翟远坤，武祥龙，梅其炳,2

(1.西北工业大学生命学院，陕西 西安 710072；2.第四军医大学药理教研室，陕西 西安 710032)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)，又名木棉(木草图经)，为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，我国特有的药用植物，国家二级保护植物。杜仲活性成分在抗肿瘤、防治骨质疏松、治疗心脑血管疾病、抗衰老、增强免疫力、安胎等方面有着良好的功效[1]，因此，杜仲活性成分的提取及分离纯化越来越受到人们的重视。

作者在此对杜仲活性成分的提取及分离纯化方法进行综述，以期为杜仲活性成分的开发与综合利用提供帮助。

1 提取方法

1.1 水提法

水提法是以水为溶剂，大多辅以加热等方式，从杜仲中提取易溶于水的成分(如绿原酸和多糖等极性较大的化合物)。

王茜等[2]比较了水、不同浓度乙醇、甲醇和丙酮水溶液等提取溶剂对杜仲叶绿原酸得率的影响，通过正交实验对绿原酸得率的主要影响因素进行了分析，结果表明，50 ℃水提绿原酸得率比较高，为1.06%，从而确定水作为绿原酸提取溶剂，在优化条件下粗产品绿原酸得率为76.51%、纯度为30.88%。魏锐等[3]利用响应面分析法优化了杜仲叶绿原酸的水提工艺，绿原酸的提取率达92.55%。董娟娥等[4]用10%的碱水在100 ℃下以提取过药用有效成分后的杜仲叶为原料提取酸性多糖，并优化了工艺条件。袁菊丽[5]用水超声提取杜仲皮中多糖，以多糖含量和得率为指标，优化了提取工艺条件，杜仲皮多糖得率为1.72%。

水提法具有成本低、无污染、能耗少、操作简便等优点，但适用范围较窄，对于不易溶于水的成分提取率低。

1.2 乙醇提取法

乙醇是一种良好的溶剂，通过调整乙醇和水的比例，可以满足大多数活性成分的提取需要。

都国栋[6]用50%乙醇在pH值约为4、体系温度为50 ℃的条件下，回流振荡浸提杜仲叶2次，每次提取3 h，绿原酸提取率超过95%，浸膏提取率约43%，绿原酸含量28%。陈晓青等[7]研究发现，65%甲醇和72%乙醇对桃叶珊瑚苷的浸提效果最好，当乙醇浓度高于72%时，浸提率下降，同时随着提取剂浓度的增大，所提取溶液的颜色加深、粘度增大，给后处理带来困难。考虑到提取溶剂的毒性及生产成本，选择72%乙醇作为提取溶剂。

乙醇提取法具有成本低、提取效率高、耗时短、清洁无污染、适用范围广、可提取杜仲中多种活性成分、溶剂容易回收、可重复利用等优点。

1.3 超声提取法

超声提取法是利用超声波的空化作用、机械作用、热效应等加快物质分子运动频率和速度，增大溶剂穿透力，从而提高目标成分浸出率的方法[8]。

超声作用可以改变植物的组织，破碎细胞，加速溶解有效成分，促进扩散和传质。超声提取适用于多种天然植物有效成分的提取，如生物碱、萜类化合物、黄酮化合物、脂质和挥发油等[9]。邓翀等[10]以甲醇和水为溶剂，采用超声法对杜仲叶中总木脂素进行提取，并通过正交实验对超声提取时间、甲醇浓度、溶剂用量等3个因素进行了优化，结果发现超声提取时间影响显著，优化条件下的木脂素平均含量达0.8843%。陈伟[11]通过正交实验确定超声浸提杜仲叶中绿原酸的最佳工艺条件为：乙醇浓度30%、提取时间30 min、料液比1∶25、提取次数3次，绿原酸含量达到0.4113%；超声浸提杜仲叶中总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度50%、提取时间20 min、料液比1∶20、提取次数3次，总黄酮含量达到1.4639%。齐惠丽[12]采用水提法、醇提法和超声法提取杜仲叶中绿原酸，结果发现，超声法得率最高、溶剂用量最少、提取时间最短。

超声法具有省时、节能、高效等优点，并且提取中无加热过程，因此可避免加热引起的药物成分结构变化，能用于热敏性成分的提取[13]。

1.4 微波提取法

微波又称超高频率电磁波，是一种波长在1～1000 mm(相对频率为300～300 000 MHz)的电磁波。微波提取技术主要是基于微波具有的热特性，可以使物料被加热，从而促进有效成分的溶出。加热原理主要有两个方面：一方面是通过介电损耗，具有永久偶极的分子在2450 MHz的电磁场中产生共振频率，使分子高速旋转，平均动能迅速增加，从而升高温度；另一方面是通过离子传导，离子化的物质在超高频的电磁场中超高速运动，因摩擦产生热效应[14]。高频电磁波到达物料内部后，由于吸收微波能，物料内温度迅速升高，细胞瞬时破碎，被提取物进入提取介质中，从而提高提取效率[15]。

Li等[16]应用二元正交分析法对微波辅助水提杜仲中京尼平苷酸和绿原酸的提取时间、微波功率、溶剂用量和溶剂组成等条件进行了优化，京尼平苷酸和绿原酸的提取时间分别为40 s和30 s，大大缩短了提取时间。陈伟[11]应用微波辅助法提取杜仲叶中绿原酸和总黄酮，确定微波浸提杜仲叶中绿原酸的最佳工艺条件为：乙醇浓度70%、提取时间25 min、料液比1∶30、微波功率600 W，绿原酸含量达到0.3425%；微波浸提杜仲叶中总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度50%、提取时间25 min、料液比1∶30、微波功率400 W，总黄酮含量达到0.7672%。彭密军[17]将微波提取技术应用于杜仲活性成分提取，同时与常规浸提、超声波提取等方法进行比较，结果发现微波提取效果最佳。

微波提取法具有提取时间短、效率高、溶剂消耗量少、易于操作、节能、无污染等优点，已广泛应用于天然产物中有效成分的提取[18]。

1.5 酶提取法

酶是一种生物反应催化剂，具有高效性、专一性和反应条件温和的特点。在药用植物有效成分提取过程中，当存在于细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时，必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力，应用纤维素酶作用于药用植物材料，使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等物质降解，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从而提高有效成分提取率[19]。

彭小文[20]考察了纤维素酶、果胶酶以及两者混合对绿原酸提取率的影响，结果显示，绿原酸提取率随着酶量的增加而上升，当纤维素酶加量为0.02%时提取率达到最高，但此后再增加酶量，提取率不再升高；优化酶作用的温度、pH值、时间等条件后，绿原酸的提取率稳定在92.0%左右。袁静等[21]采用分步添加纤维素酶和果胶酶的方法提取绿原酸，先在pH值为5、温度为45 ℃时加入纤维素酶作用10 min，然后在pH值为4、温度为55 ℃时加入果胶酶作用10 min，最后用水提取杜仲叶中绿原酸，处理并重结晶后得到纯品，结果表明虽然酶法比传统方法粗产品产量少，但由于其中杂质含量低，绿原酸含量提高5.7%，绿原酸提取率也提高2.4%。Luo等[22]研究发现，酶法提取杜仲叶中抗氧化成分比水提法效率更高，酶提取法是替代常规方法的一种有效方法。

酶提取法具有提取时间短、提取率高、杂质含量低、无溶剂残留、所需设备简单、可操作性强等优点。酶反应在较温和的条件下将植物组织分解，使有效成分暴露出来，较大幅度地提高了药物有效成分的提取率和纯度[23]，且其温和的反应条件有利于保持提取物的生物活性，在热敏性物质提取中具有独特的应用。但酶法目前在杜仲有效成分提取中的应用较少。

1.6 超临界CO2流体萃取法

超临界流体指处于临界温度和临界压力以上的流体。CO2由于适中的临界条件、无毒、无燃爆危险等优点成为最常用的超临界流体[24]。超临界流体萃取(Supercritical fluid extraction，SFE)是利用超临界条件下的液体作为萃取剂，从液体或固体中萃取出特定成分的技术[25]。

李秋红等[26]应用超临界CO2流体提取杜仲叶中总黄酮，通过正交实验确定最佳工艺为：萃取时间2.5 h、压力300 MPa、温度45 ℃、夹带剂(乙醇)用量3.5 mL·g-1，在此条件下，总黄酮提取率为73.26%、纯度为19.82%。麻成金等[27]将超临界CO2流体萃取应用于杜仲籽油的提取中，并与常规溶剂(石油醚)提取、微波提取进行了比较，认为超临界CO2流体萃取所得杜仲籽油的品质最优，是提取优质杜仲籽油的首选方法。此外，Li等[28]应用超临界CO2流体萃取桃叶珊瑚苷也取得了良好效果。

超临界CO2流体萃取法工艺简单、效率高，可以在近常温的条件下提取分离，产物容易进一步分离，对于提取分离脂溶性物质、挥发性成分和高热敏性物质等有效成分具有独特的优势[27,28]。但是该法对设备的要求及能耗相对较高，从而限制了其广泛应用。

2 分离纯化方法

2.1 溶剂萃取法

溶剂萃取法通常依据相似相溶的原理选择溶剂，利用物质在两种不互溶(或微溶)溶剂中溶解度或分配比的不同来达到分离或纯化的目的。溶剂萃取法易受到溶剂极性大小、pH值、提取温度、提取次数、溶剂用量和样品粒度等多种因素的影响[29]。柳娜等[30]对杜仲中木脂素类化合物纯化工艺进行了研究，将溶剂萃取作为初级纯化，即先用乙酸乙酯萃取浸提液3次以除去部分杂质，再用正丁醇萃取乙酸乙酯萃余液2次，合并正丁醇的萃取液，减压蒸馏浓缩再进行后续纯化。

近年来发展的双水相体系萃取在杜仲活性成分的分离纯化中也得到了应用，当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化的目的[31]。彭胜等[32]建立了一种由聚乙二醇与葡聚糖形成的双水相体系萃取分离杜仲叶中桃叶珊瑚苷的新方法，桃叶珊瑚苷纯度达到48.67%，远远高于粗提物中的8.75%。

溶剂萃取法具有应用范围广、操作简单、萃取溶剂可以回收再利用的特点，但萃取所得某一相中仍然含有多种性质类似的化合物，更适合杜仲中活性物质的初级分离。

2.2 大孔树脂色谱法

大孔吸附树脂具有很大的比表面积，是吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料，一方面通过分子间作用力(范德华引力或氢键)对被吸附的分子进行吸附;另一方面树脂具有一定的孔径，不同分子大小的化合物经过树脂柱时，又起到一定的分子筛作用，从而达到良好的分离效果[33]。

陈伟[11]通过静态吸附分离实验和动态分析筛选出HPD600为纯化绿原酸和总黄酮的最优材料。此外，XAD-5和NKA-2型大孔树脂在杜仲绿原酸的分离中也具有较好的效果[6,34]。曹慧[35]经萃取和吸附除杂后选择A型大孔吸附树脂纯化杜仲中京尼平苷和京尼平苷酸，总收率分别达到84.15%和73.49%。戚向阳等[36]采用D101型树脂有效吸附分离杜仲皮中的双环氧木脂素二糖苷，将上样液pH值调至10～12,分别用水、30%乙醇进行洗脱，收集30%乙醇洗脱液并进行浓缩和真空干燥，粗提物的产率为1.74%,其松脂醇二葡萄糖苷(PG)和丁香脂醇二葡萄糖苷(SG)含量分别为8.1397%和2.9431%。李辉等[37]用HZ-820型树脂进行柱层析分离纯化桃叶珊瑚苷，重结晶后纯度高达96.82%。

大孔树脂色谱法具有选择性好、吸附量大、效率高、易洗脱、再生容易和成本低等优点，特别适用于水溶性化合物的分离纯化。在杜仲木脂素、环烯醚萜、皂苷、黄酮、绿原酸等的纯化中应用广泛，效果好。

2.3 硅胶色谱法

硅胶色谱法是根据物质在硅胶上的吸附性不同而使物质得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较小的物质不易被硅胶吸附，整个过程就是吸附、解吸、再吸附、再解吸的分离过程[33]。

曹慧等[38]采用硅胶色谱法分离环烯醚萜类化合物，采用干法上硅胶柱，用不同配比的氯仿和甲醇混合液洗脱，同时用高效液相色谱法跟踪检测，所得京尼平苷酸和京尼平苷的纯度分别达到98.69%和96.54%。柳娜等[30]采用硅胶色谱法同时分离纯化杜仲中松脂醇二葡萄糖苷和丁香脂醇二葡萄糖苷，纯度分别为90.86%和91.73%。李辉等[39]采用硅胶色谱法从杜仲粕中分离纯化桃叶珊瑚苷，经重结晶后可获纯度为96.56%的产品。

硅胶色谱法在杜仲中木脂素类、环烯醚萜类和苷类化合物的分离中应用较广，一般采用梯度洗脱结合高效液相色谱等先进检测手段可以得到较纯化合物。但是硅胶色谱法周期一般较长，硅胶也不易再生。

2.4 制备型高效液相色谱法

制备型高效液相色谱(PHPLC)克服了传统的分析型高效液相色谱分离样品量少的缺点，使产品的分离量达到克数量级及以上，并最终实现了工业化[40]。戚向阳等[36]对样品进行预处理后，再经PHPLC分离纯化和重结晶，得到松脂醇二葡萄糖苷和丁香脂醇二葡萄糖苷白色结晶，纯度达到色谱纯。彭密军等[41]采用PHPLC法，以乙醇-水-乙酸为流动相、选用台阶梯度洗脱方式同时制备了京尼平苷酸、京尼平苷、桃叶珊瑚苷等3种环烯醚萜类成分。

制备型高效液相色谱法具有柱效高、分离速度快等特点，是制备纯化天然产物和化学合成产物的极好手段，在医药工业、生化技术和精细化学品的生产中已有重要的应用[41,42]。但制备型高效液相色谱法只适用于纯度较高、成分较单一的一种或几种物质的纯化，对样品要求较高，否则很难达到良好的分离度。

2.5 其它分离纯化方法

凝胶色谱法、制备薄层色谱法、膜过滤和新材料技术在杜仲活性成分的分离纯化中也有应用。

凝胶色谱法是根据分子筛效应对不同分子量的化合物实现分离，张玲等[43]以凝胶色谱法从杜仲叶中分离得到4种组分，纯度均超过95%，但目前凝胶填料较贵。程德军等[44]通过两次制备薄层色谱得到的绿原酸纯度超过91.6%，所建立的纯化制备方法简便、直观，对绿原酸有很好的分离效果，适合于数百毫克级到克级的制备。彭小文[20]以微滤膜和纳滤膜处理绿原酸水提液后，有利于后续分离纯化。Li等[45]应用新型分离材料分子印迹聚合物对绿原酸进行分离纯化，取得了良好效果。

3 结语

综上所述，杜仲中不同类活性成分提取和分离纯化可采用相同的方法，而同一类化合物又可以采用不同方法进行提取和分离纯化。为全面开发杜仲活性成分，针对杜仲活性成分提取和分离纯化方法，提出如下几点建议：(1)采用微波或超声波辅助乙醇进行提取，提取过程中先用低浓度的乙醇，然后定时加入乙醇，逐步增大乙醇浓度，可达到高效充分提取各活性成分的目的。(2)提取液浓缩后采用不同极性有机溶剂依次萃取，进行除杂和初步分离，有利于后续纯化。(3)木脂素类、环烯醚萜类和苷类化合物的分离既可以采用大孔树脂色谱法也可以采用硅胶色谱法，应优先选择大孔树脂色谱法。(4)大孔吸附树脂可同时分离多种化合物，应用乙醇梯度洗脱法，分别收集各梯度洗脱液进行鉴定和后续纯化。(5)应用高效液相色谱或者制备型高效液相色谱等现代检测纯化工具，收集相同组分，可达到事半功倍的效果。

参考文献：

[1] 李竹，晏媛，李青.杜仲的药理活性研究进展[J].中国药事，2004，18(2)：131-132.

[2] 王茜，李智，何琦，等.杜仲叶中绿原酸提取分离工艺条件的研究[J].离子交换与吸附，2008，24(1)：73-80.

[3] 魏锐，田惠玲，周建军，等.响应面分析法优化杜仲叶中绿原酸水提工艺[J].安徽农业科学，2011，39(7)：3965-3967，3970.

[4] 董娟娥，梁宗锁，靳爱仙，等.杜仲叶酸性多糖提取分离及含量测定[J].林业科学，2006，42(10)：59-64.

[5] 袁菊丽.超声提取杜仲多糖的工艺优化[J].应用化工，2011，40(5)：817-818.

[6] 都国栋.杜仲叶中绿原酸的提取、分离纯化工艺研究[D].贵阳：贵州大学，2006.

[7] 陈晓青，贺前锋，曹慧，等.杜仲皮中桃叶珊瑚甙的提取及纯化[J].中南大学学报(自然科学版)，2005，36(1)：60-64.

[8] 张涛，王桂清.植物源抑菌杀菌物质提取方法研究进展[J].广东农业科学，2011,(13):59-62.

[9] 姜红波.植物有效成分提取方法的研究[J].应用化工，2011，40(3):528-530,534.

[10] 邓翀，颜永刚，杨乖利，等.正交试验设计优化杜仲总木脂素提取工艺[J].中国中医药信息杂志，2011，18(8)：45-46.

[11] 陈伟.杜仲叶片绿原酸、总黄酮的提取分离纯化技术研究[D].南京：南京农业大学，2007.

[12] 齐惠丽.杜仲叶中绿原酸提取工艺研究[D].天津：天津大学，2007.

[13] 钟玲，尹蓉莉，张仲林.超声提取技术在中药提取中的研究进展[J].西南军医，2007，9(6)：84-86.

[14] 韩丽.实用中药制剂新技术[M].北京：化学工业出版社，2002：148-149.

[15] 高虹，谷文英，丁霄霖.利用微波辅助提取测定姬松茸中麦角甾醇含量[J].浙江大学学报(农业与生命科学版)，2007，33(1)：113-118.

[16] Li Hui，Chen Bo，Zhang Zhaohui，et al.Focused microwave-assisted solvent extraction and HPLC determination of effective constituents inEucommiaulmodiesOliv.(E.ulmodies)[J].Talanta，2004，63(3)：659-665.

[17] 彭密军.杜仲中高纯活性成分的分离制备新工艺研究[D].长沙：中南大学，2004.

[18] Spigno G，De Faveri D M.Microwave-assisted extraction of tea phenols：A phenomenological study[J].Journal of Food Engineering，2009，93(2)：210-217.

[19] 张树政．酶制剂工业[M]．北京：科学出版社，1984：65-80．

[20] 彭小文.膜分离集成树脂技术制取杜仲绿原酸的工艺研究[D].武汉：湖北工业大学，2010.

[21] 袁静，毛建.酶法提取杜仲叶中绿原酸的实验研究[J].四川师范大学学报(自然科学版)，2007，30(5)：657-659.

[22] Luo Jiyang，Tian Chengrui，Xu Jianguo，et al.Studies on the antioxidant activity and phenolic compounds of enzyme-assisted water extracts from Du-zhong (EucommiaulmoidesOliv.) leaves[J].Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry，2009，24(6)：1280-1287.

[23] Jones N M,Bernardo-Gil M G,Lourenco M G.Comparison of methods for extraction of tobacco alkaloids[J].J AOAC Int，2001，84(2):309-316.

[24] Johnston K P，Harrison K L，Clarke M J，et al．Water-in-carbon dioxide microemulsions:An environment for hydorophiles including proteins[J]．Science，1996，271(5249)：624-627.

[25] Turner C，Eskilsson C S，Bjorklund E.Collection in analytical-scale supercritical fluid extraction[J].Journal of Chromatography A，2002，947(1)：1-22.

[26] 李秋红，罗莉萍，叶文峰.超临界CO2萃取杜仲叶总黄酮的研究[J].食品科学，2006，27(12):553-555.

[27] 麻成金，张永康，马美湖，等.微波和超临界CO2萃取杜仲籽油工艺研究[J].食品科学，2006，27(6)：131-135.

[28] Li Hui，Hu Jiangyu，Yang Huiou，et al.Extraction of aucubin from seeds ofEucommiaulmoidesOliv. using supercritical carbon dioxide[J].Journal of AOAC International，2009，92(1)：143-150.

[29] 汪茂田，谢培山，王忠东，等．天然有机化合物提取分离与结构鉴定[M]．北京：化学工业出版社，2004:54-57．

[30] 柳娜，陈晓青，杜晖，等.杜仲中木脂素类化合物纯化工艺研究[J].化学通报，2006，69(4)：302-305.

[31] 徐长波，王巍杰．双水相萃取技术研究进展[J]．化工科技，2009，17(2)：75-79．

[32] 彭胜，彭密军，卜晓英，等.双水相体系萃取分离杜仲叶中桃叶珊瑚甙的研究[J].天然产物研究与开发，2010，22(2)：264-267.

[33] 谷成燕.AB-8大孔树脂与硅胶柱层析分离姜酚的对比[D].济南：山东大学，2009.

[34] 卢琪，段家彩，高丽，等.杜仲绿原酸的分离纯化及结构鉴定[J].食品科学，2010，31(14)：275-279.

[35] 曹慧.杜仲中降压活性成分的分离和表征研究[D].长沙：中南大学，2005.

[36] 戚向阳，陈维军，张声华.杜仲中双环氧木脂素二糖苷分离纯化技术的研究[J].林产化学与工业,2005，25(4)：47-50.

[37] 李辉，文赤夫，李亚男，等.杜仲粕中桃叶珊瑚苷的分离和纯化[J].食品科学，2011，32(2)：32-35.

[38] 曹慧，陈晓青，肖建波，等.杜仲中京尼平甙酸的硅胶柱色谱分离纯化及反相高效液相色谱/液相色谱-电喷雾质谱/核磁共振鉴定[J].色谱，2005，23(5)：534-537.

[39] 李辉，汪兰，彭玉丹，等.硅胶柱层析法分离纯化杜仲粕中桃叶珊瑚苷[J].食品科学，2010，31(14)：58-61.

[40] 杨振寰，刘霞.制备高效液相色谱在天然产物分离中的应用[J].中成药，2005，27(12)：1444-1448.

[41] 彭密军，周春山，董朝青，等.制备液相色谱-台阶梯度法分离纯化杜仲中三种环烯醚萜化合物[J].色谱，2004，22(2)：184.

[42] Puri S，Handa G，Kalsotra A K，et al.Preparative high-performance liquid chromatographic separation of naphthodianthrones from St.John′s Wort[J].Journal of Chromatographic Science，2006，44(4)：177-180.

[43] 张玲，刘青梅，杨性民，等.杜仲叶绿原酸总黄酮的分离纯化及检测[J].湖南农业科学，2009,(12)：122-125.

[44] 程德军，梁冰，董海英,等.两次制备薄层色谱分离纯化杜仲叶中的绿原酸[J].西南民族大学学报(自然科学版)，2007，33(3)：542-545.

[45] Li Hui，Liu Yingju，Zhang Zhaohui，et al.Separation and purification of chlorogenic acid by molecularly imprinted polymer monolithic stationary phase[J].Journal of Chromatography A,2005,1098(1-2)：66-74.