毛细管电泳技术在蛋白质生物制品分析中的应用研究进展

曹卫荣,张世光,王晓婧,周青青,邹 卫

(石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司,河北 石家庄 050051)

毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE)，又称高效毛细管电泳(High-performance capillary electrophoresis，HPCE)，是近20年迅速发展的一种快速的分离分析技术[1]。毛细管电泳是以毛细管为分离通道，由高压电场提供驱动力，根据待分析物质各组分在毛细管内淌度或分配系数的不同，即各组分沿管轴方向运动速度的差异来实现对组分的分离。与传统的液相色谱相比，具有高效、快速、微量、操作简便、经济等优点[2～4]，利用毛细管电泳技术可以分离从离子到中性分子、从小分子到生物大分子等一系列物质，广泛应用于化学、生物、医学、环境科学等领域，被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究领域。毛细管电泳技术已实现了纳升水平分离分析，是继高效液相色谱之后的分析化学史上又一重大进展。

蛋白质生物制品是当今生物医药产业的重要组成部分，近年来随着DNA重组与克隆技术的飞速发展，重组蛋白类药物的研发和生产成为了医药行业的热门之一，但其分子量大、结构复杂，因此较难鉴别和定量分析，是阻碍其快速发展的主要因素。毛细管电泳技术用于蛋白质生物制品的分析具有明显的优势。作者在此就近年来国内外毛细管电泳技术在蛋白质生物制品分析中的应用研究进展进行了综述。

1 毛细管电泳的演变

毛细管电泳最初始于瑞典籍生化学家Tiselius于1937年设计的一套分离蛋白质的电泳装置，因其在血清蛋白分析上的斐然成就，Tiselius于1948年获得诺贝尔化学奖[5]。20世纪80年代是毛细管电泳技术加速发展时期，先后出现了熔融石英毛细管、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、胶束电动毛细管色谱、毛细管电色谱。1981年，Jorgenson和Luckas用石英毛细管进行电泳分析，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术[6]。1989年，第一台商品化毛细管电泳仪问世。短短几年内，由于毛细管电泳符合生命科学领域对多肽、蛋白质(包括酶、抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求，而得到了迅速发展。

2 毛细管电泳的分类

2.1 毛细管区带电泳(Capillary zone electrophoresis，CZE)

CZE又称自由溶液毛细管电泳，是目前毛细管电泳中最简单、最基础、应用最广泛的电泳技术。CZE是以具有pH值缓冲能力的电解质溶液为载体，根据被分析物电泳淌度的不同实现分离。CZE的应用范围宽，能分离小分子药物、氨基酸、多肽类、对映体等带电物质，但不能分离中性物质。

2.2 毛细管凝胶电泳(Capillary gel electrophoresis，CGE)

CGE是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，溶质按分子大小逐一分离。CGE对于大分子物质如抗体、蛋白多肽、寡聚核苷酸的分离分析，特别是DNA序列分析显示了速度和效率方面的优越性。主要缺点是制备较困难、寿命较短、使用时易产生空泡。

2.3 毛细管等电聚焦电泳(Capillary isoelectric focusing，CIEF)

CIEF是一种基于等电点分离生物大分子的电泳技术。通过内壁涂层使电渗流减到最小，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别为酸和碱，加高电压后，在毛细管内形成了pH值梯度。溶质迁移到相当于其等电点的位置时停止，由此产生一个非常窄的聚集区带，不同等电点的溶质聚集在不同的位置上，形成一个个独立的溶质区带而彼此分开。该电泳技术分辨率较高，主要用于分离两性化合物。

2.4 毛细管等速聚焦电泳(Capillary isotachophresis，CITP)

CITP是基于离子淌度分离带电离子的技术，属于不连续介质电泳。采用先导电解质充满整个毛细管柱，淌度高于任何样品组分；再将尾随电解质置于一端的电泳槽中，淌度低于任何样品组分。溶质按其电泳淌度不同得以分离。该电泳技术常用作柱前浓缩以富集样品。

2.5 毛细管胶束电动色谱(Capillary micellar electrokinetic chromatography，MEKC)

MEKC是日本Terabe等在1984年提出在缓冲溶液中加入表面活性剂十二烷基磺酸钠而建立的。其原理是当表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，形成胶束。溶质按照其疏水性不同在水相和胶束相之间分配而得以分离。MEKC既能分离带电物质又能分离中性物质，如引入手性添加剂环糊精及其衍生物形成的手性胶束，则可进行手性药物的拆分分离[7]。

2.6 毛细管电色谱(Capillary electrochromatography，CEC)

CEC也称填充柱毛细管电色谱，将HPLC中使用的众多固定相填充到毛细管中或涂敷在毛细管壁上，毛细管两端的高压电相当于高压泵，以电渗流作为驱动力，使样品在两相间进行分配得以分离。该电泳技术兼具了电泳和液相色谱的分离机制，提高了选择性，虽然柱效较低、应用不多，仅在免疫学、药物分析、富勒烯化学等领域有所研究，但却是一种很有发展前景的电泳技术。

3 毛细管电泳技术在蛋白质生物制品分析中的应用

3.1 取代平板凝胶技术——CE-SDS

CE-SDS是一种高效、快速的分离分析蛋白质生物制品的方法，用于评估蛋白质生物制品的纯度、特性和稳定性[8]。对于蛋白质生物制品来说，其大小异质性程度很高[9，10]，CE-SDS是评估蛋白质生物制品大小异质性的一种强有力方法。以重组人源化单克隆抗体(rhuMAbs)为例，其大小变异体包括：游离的轻/重链片段、蛋白质的断裂片段[11]、不可分离的更高分子量的种类、二硫键异构体、糖基化位点相关的种类等。传统电泳技术不能有效检测抗体的异质性，而CE-SDS具备可任选择的检测灵敏度：UV检测(考马斯亮蓝染色的灵敏度)、LIF检测(银染色的灵敏度)，能够快速准确地检测抗体大小异质性。另外，CE-SDS可以实现样品制备自动化，大幅提高了样品分析的效率和精确度。

最近有基于CE-SDS方法对治疗性单克隆抗体(rMAb)成功进行分析的报道[12]。rMAb标准品是一个轻链(LC)、非糖基化重链(NGHC)和重链(HC)的混合物。CE-SDS较强的分离能力主要体现在对HC和NGHC两者之间的分辨率，因为NGHC含量很低(<5%)，传统方法很难准确检测。采用CE-SDS分析这些组分相对迁移时间的相对标准偏差为2%，通过峰面积对这些组分进行定量，其相对标准偏差<9%。

大部分蛋白都存在糖基化修饰，用SDS凝胶电泳测定糖蛋白的分子量存在着困难，因为糖蛋白的寡糖链不结合SDS，引起荷质比降低，导致糖蛋白分子量测定不准确。Ferguson分析方法指出：在不同的凝胶浓度下对糖蛋白进行SDS-PAGE分析，可消除寡糖对糖蛋白分子量测定的影响，这种方法在CE-SDS中同样适用[13]。

3.2 HPLC技术的辅助手段——CZE

CZE高效、快速、简便的特点使其在蛋白质、多肽分离及纯度鉴定方面应用日益普遍，尤其是生物技术和基因工程中大量生物合成的蛋白质、多肽能用CZE进行有效的分离分析，以确定产品的纯度、均一性及生产过程的可靠性。目前，CZE在蛋白质和多肽分析中的用途主要包括：蛋白质、多肽的分离及纯度鉴定；蛋白质、多肽的结构分析；监测蛋白质、多肽的反应过程及结构变化。另外，蛋白质生物制品电荷异质化程度高，CZE也是快速分析蛋白质生物制品电荷异质性的重要手段之一[14]。Ma[15]首次使用CZE分析治疗性单克隆抗体(mAbs)的电荷异质性，使用涂层毛细管以消除蛋白质对毛细管的吸附，结果显示：CZE能够快速准确地分析mAbs的电荷异质性。He等[16]使用CZE成功实现了几种mAbs及其电荷异质体的分离，并使用浓缩的两性离子缓冲溶液以及酸性溶液来抑制电渗流和蛋白质吸附。

高效液相色谱法在分析蛋白质、多肽及核酸等生物大分子时，因样品组分扩散系数小、传质阻力大而导致分离效率较低。Aeberold设计了一种柱上电泳富集方法，使CZE适用于分析HPLC分离后浓度较低的肽段，并认为CZE是鉴定HPLC收集的毫克级以下肽段纯度最有效的方法[17]。

应用CZE分离蛋白质、多肽具有其独特的优越性，同时也存在峰容量小、难以大量制备的缺点，因此其并不能完全取代其它分析方法(如HPLC)，但至少是一项有效的补充手段。目前，CZE在生物大分子领域的分析还处于起步阶段，随着其研究和应用的深入，CZE有望在蛋白质、多肽等生物分子的实际分析中发挥更重要的作用。

3.3 碳水化合物分析——CE/CE-MS

由于寡糖链不但能参与细胞识别和分子识别，还参与糖蛋白的分拣(Sortins)和投送(Toffickins)、抗体依赖的细胞毒性[18]等细胞过程，并且在蛋白质合成过程中由于环境条件的改变寡糖表面很容易发生改变，因此表征蛋白质药物上糖结构的分析方法非常重要，但由于寡糖链异质化程度高，糖基化分析具有极大的挑战性。糖链表征的最常用技术包括HPLC、MS和CE，其中CE柱效高、分析速度快[19]，是分析蛋白质生物制品糖基化结构的重要手段，目前已在蛋白质生物制品质量控制中广泛应用。CE主要用于蛋白质药物表面的N-低聚糖、单糖的定量分析(暴露末端单糖残基，即半乳糖和β-N-乙酰氨基葡萄糖)。Ma等[19]使用CE对利妥昔单抗(Rituximab)进行糖基化分析，结果显示：此方法简便、精确度和准确度高，可以用于大批量样品日常检测。

另外对于CE分析中小峰表征的难题，可以采用CE-MS，CE-MS不仅具有强大的分离能力，而且具有质谱的灵敏度。CE-LIF-MS技术已被成功地用于微量碳水化合物样品的直接鉴定。Gennaro等[20]用在线CE-LIF-MS 分析了来自药用单克隆抗体(mAb)中的碳水化合物，可对微量组分进行鉴定和定量。随着CE与MS仪器的发展、接口技术的不断完善，CE-MS技术必将成为生物制品碳水化合物分析强有力的工具，并促进生物制品分析领域的迅猛发展。

3.4 检测蛋白质等电点——CIEF

每个蛋白质都有唯一的等电点(pI)和/或电泳曲线图，用已知等电点的蛋白质作为标准进行电泳，以等电值作纵坐标、相对迁移值作横坐标，绘制标准工作曲线，再得出未知物的相对迁移值，即可求其等电点。由于蛋白质、多肽的电荷异质性程度比较高，主要是由于部分糖基化、蛋白质骨架裂解、脱酰氨基作用引起，CIEF能够准确检测蛋白质、多肽的电荷异质性[21，22]，从而能够准确计算出蛋白质、多肽样品的纯度。Ongay等[23]采用CIEF测定了来源于不同细胞的重组人源化VEGF165的pI值，并比较了昆虫细胞和大肠杆菌表达的重组人源化VEGF165的pI值差异。

3.5 高通量的分离技术——微芯片毛细管电泳(MCE)

MCE是将CE移植到芯片上，将样品进样、反应、分离、检测等过程集成到一起的多功能化的快速、高效、低耗微型技术。

MCE与CE相比有许多优点，如进样量小、散热性能好，因此允许使用较高的电场，可以大大加快分离速度，另外通过多通道设计及通道设计的任意性实现了芯片的高通量、集成化，目前已经在蛋白质分析中得到了广泛的应用。如Rodriguez等[24]在微芯片上采用MCE高效分离了FITC标记的氨基酸对映异构体等。然而，MCE还处于起步阶段，技术还不成熟，但其突出的优点与广阔的应用前景，使MCE成了分析化学一个发展迅猛的领域。关键问题仍集中于微型化、集成化、高通量和接口设计等几个方面[25，26]，其中芯片微通道的设计布局与芯片制作技术仍将是该领域研究的重点。

4 展望

作为一种高效分离分析方法，毛细管电泳在蛋白质生物制品分析领域显示了独特的优势，并得到了广泛的应用。随着新型检测器、新型分离材料、仪器微型化等方面的研究以及毛细管电泳技术与其它技术(如HPLC、MS等)的联合应用的进一步深入，毛细管电泳在系统重现性、自动化程度以及检测灵敏度方面都有了大幅提高，可以预言，毛细管电泳在未来生物制品分析领域中的前景会更加广阔。其中，毛细管电色谱和微芯片毛细管电泳以其样品微量性、分离效率高、速度快、费用低等优点将成为推动毛细管电泳技术迈向常规检测技术的重要力量。

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