雪旺细胞体外培养与纯化的研究进展

付红运，王锐英

（桂林医学院附属医院骨科，广西桂林541000）

雪旺细胞体外培养与纯化的研究进展

付红运，王锐英*

（桂林医学院附属医院骨科，广西桂林541000）

雪旺细胞在周围神经损伤后在修复过程中所起的重要作用，使其成为在神经科学研究领域中应用最广泛的细胞。在雪旺细胞提取过程中，由于其与成纤维细胞较难分离，导致雪旺细胞被成纤维细胞污染的概率较高，因此如何应用有效的方法来提取雪旺细胞，尽可能的在短期内获得纯度较高的雪旺细胞成为一研究热点。目前对于雪旺细胞的提纯及培养有多种方法，本文就目前国内外新近雪旺细胞提纯及培养的技术做一综述，为雪旺细胞的提纯及培养提供一定的借鉴。

雪旺细胞；体外培养；纯化

雪旺细胞是周围神经系统中的成髓鞘细胞，主要分布于周围神经系统中神经元的突起周围，其能够分泌多种神经生长因子及促突起生长因子来营养、趋化神经和促进轴突的再生[1]。雪旺细胞由于其自身分泌功能在人工神经中通常作为种子细胞，并且起到核心的作用。在周围神经损伤中，可出现雪旺细胞的增殖[2]，在人工神经中雪旺细胞和嗅球成鞘细胞联合应用，可以使缺损神经再生速度达到自体神经移植同样的效果[3]。

1 雪旺细胞的来源及取材

1.1 雪旺细胞的来源目前用于培养雪旺细胞的宿主主要来源于哺乳类动物，包括大鼠、兔、灵长类动物及人本身。Casella等[4]通过实验发现：随生物进化程度增高，培养难度也就随之增大。在动物的胚胎及新生期，雪旺细胞具有较强的增殖能力，并且随着动物年龄的增大，雪旺细胞的免疫排斥反应变强，增殖能力也下降，所以用于研究的雪旺细胞多取材于胚胎、新生动物[5]。

1.2 雪旺细胞的取材雪旺细胞主要的取材部位是坐骨神经、腓肠神经及背脊神经。为提高雪旺细胞的含量，Kraus等[6]在提取雪旺细胞之前，提前坐骨神经离断，经过1～2 W的瓦勒变性后，坐骨神经中雪旺细胞的含量较未经过瓦勒变性的坐骨神经增加了50%。不同部位的取材各有优缺点，坐骨神经较背脊神经容易获取，但由于其神经外膜完全剥离较困难，体外分离时耗时较长，影响了细胞的活性，而背根神经节几乎无神经外膜，获取雪旺细胞较为容易，取材于背根神经节获得的雪旺细胞的数量、纯度及活性都优于坐骨神经[7]，取材于背根神经节的雪旺细胞在以后的培养过程中增殖能力也优于坐骨神经[8]。此外，不同来源的雪旺细胞在培养过程中也表现出不同，来源于感觉性神经的雪旺细胞其神经生长因子的表达水平要优于运动性神经[9]。

2 雪旺细胞的培养纯化方法

分离雪旺细胞的脊神经、背根神经节等都有外膜和内膜的包被，内膜及外膜中含有大量的成纤维细胞，其在体外培养过程中生长速度比雪旺细胞快，成为污染雪旺细胞的主要细胞类型。如不将其剔除干净，在培养过程中难免会污染雪旺细胞。应用显微解剖镜剥除外膜，也难免留下少量成纤维细胞，影响污染雪旺细胞纯度，所以很多学者主张在解剖及培养的过程中尽可能的剔除及杀死成纤维细胞，提高雪旺细胞的浓度。

2.1 双向差速法将制备好的雪旺细胞悬浮液接种于多聚赖氨酸铺被的培养瓶中，静置30 min，利用成纤维细胞沉降速度比雪旺细胞快、多聚赖氨酸对其吸附性高的特点，使大部分成纤维细胞贴壁。雪旺细胞处于悬浮状态，此时悬浮液中含有的成纤维细胞将大大减少，放入新的培养液中继续培养48 h，除去上清液。利用两者贴壁能力的差异，用0.05%的复合胶原酶消化30 min，将贴壁能力弱的雪旺细胞首先被消化下来，由于成纤维细胞的贴壁能力较强而被遗留，利用此法可进一步去除成纤维细胞[10]。

2.2 差速分离法将制备好的雪旺细胞混悬液放入加有胎牛血清、毛喉素、调蛋白-β-1的α-MEM培养液(SCCM)中，将上述细胞悬液转入涂有层粘连蛋白的烧瓶中培养。48 h后将培养液替换为被α-MEM稀释过的复合胶原酶中，在37℃下孵育30 min，然后震荡30～60 s，离心5 min后，弃上清液。将下层沉淀继续放入SCCM中悬浮，将细胞悬液转入同样涂有层粘连蛋白的烧瓶中进行第二轮的纯化。利用复合胶原酶对两者的消化能力的不同，第一轮纯化后雪旺细胞的纯度约68%，经过第二轮的纯化，雪旺细胞的纯度可达到98%[11]。

2.3 层粘连蛋白吸附法利用层粘连蛋白与雪旺细胞亲和力较强的特点[12]，把制备好的雪旺细胞悬液放入涂有层粘连蛋白的烧瓶中，使雪旺细胞被吸附入层粘连蛋白中，而成纤维细胞与层粘连蛋白亲和力较差，则继续留在混悬液中，30 min后将烧瓶中上清液弃掉，重新加入培养液，如此往复循环5次。随着每次循环，雪旺细胞的纯度也随之增加，经过第1次循环后雪旺细胞纯度72%～75%，经过5次循环，纯度可高达90%[13]。

2.4 神经调节蛋白1纯化法Rosenfeldt等[14]发现，成纤维细胞在浮动的胶原酶环境中减弱了细胞外信号调节激酶途径，在此环境中成纤维细胞会发生退化而非增殖。基于此法，Isabel等[15]用加有10%胎牛血清、青霉素及重组人调节蛋白1的CGM培养基，在15%CO237℃条件下培养7 d。7 d后，用Hank's平衡盐溶液冲洗，将其剪碎后在加有胰蛋白酶2型、胶原酶2型的CGM培养液中孵育，然后用1 ml吸管吹打，把混悬液离心3 min后用DMEM培养液将离心后的细胞悬液冲洗两遍后继续放入CGM培养基中培养。待基地细胞生长至融合交汇后用加有Ca2+、Mg2+的Hank's培养液冲洗三遍，经免疫细胞学检查后S100纯度可达到83%。

2.5 MGM培养基抑制法用涂有层粘连蛋白的DMEM培养基培养雪旺细胞混血液24 h，然后用加有毛猴素、成纤维细胞生长因子及牛脑垂体提取物的黑色素细胞培养基(MGM)替代DMEM培养基。待75%细胞相互融合后，用PBS缓冲液及钙离子螯合剂冲洗，然后晃动培养瓶2～4 min，随后进行离心10 min。应用此法，经免疫细胞学检测p75纯度可达到99%[16]。

2.6 低浓度酶溶液培养法将制备好的雪旺细胞悬液放入加有盘尼西林及链霉素的10%FBS液中培养，待细胞长满后，将细胞移入涂有聚-L-赖氨酸的培养皿中进行传代培养，培养液使用10%FBS，培养2 d后更换培养液以便移除残余组织碎片及无活性的细胞。等待细胞长至相互融合后，用0.25%胰蛋白酶替代培养皿中上清液，使贴壁的细胞脱离瓶壁。消化完成后在混悬液中加入10 ml PBS再次离心，弃上清，用完全培养基继续培养，24 h后改用2.5%PBS液。连续培养10 d，雪旺细胞纯度可达到97%[17]。

2.7 抗有丝分裂法将制备好的雪旺细胞混悬液用雪旺细胞纯化培养液(加有10%FBS 10 μmol/L Ara-C 1%双抗的DMEM/F-12培养液）消除成纤维细胞，24 h后用DMEM/F-12培养液冲洗去除细胞碎片，继续用促雪旺细胞生长培养液培养48 h，48 h用PBS液和0.05%胰蛋白酶冲洗。把雪旺细胞基础培养液以4：1加入终止酶反应，800～1 000 r/min离心5 min，弃上清。将混悬液继续放入培养基中培养至细胞相互融合，然后用PBS液和2.5%胰蛋白酶冲洗两次，用FBS终止酶反应，继续以800～1 000 r/min离心5 min，弃上清，混悬液继续培养。经过以上步骤，免疫细胞学检测S100纯度可达99.4%[18]。

2.8 免疫磁珠法将制备好的细胞混悬液接种7 d后，加入0.25%胰蛋白酶，制备成细胞悬液，然后加入Mouse Anti-p75LNGFr，37℃培养10 min后，加入免疫磁珠。再于37℃条件下培养15 min，置于磁性离心器上，吸去上清后加入含20%胎牛血清的DF12培养液，在5%CO237℃培养24 h，再次置于磁性离心器，取上清移至培养瓶中继续培养，培养2 d后即可进行传达培养。经过此法培养2 d后，雪旺细胞活力约96%，纯度约为98%[19]。

3 影响雪旺细胞体外培养增殖的因素

雪旺细胞在体外培养的环境不同于体内，没有体内环境稳定，在培养过程中容易受外界因素的影响，培养基中某一物质浓度的高、低及加入某一物质都会影响雪旺细胞的增殖与否。

3.1 胎牛血清对雪旺细胞的影响血清在细胞培养中不仅提供细胞生长的必需成分，而且为细胞在培养基中贴壁、铺被提供所需因子。Komiyama等[20]已经证实，不同浓度的胎牛血清对雪旺细胞的增殖影响也不同。分别用0%～10%胎牛血清培养雪旺细胞，当胎牛血清浓度为10%时，不仅可以促进雪旺细胞的快速增殖，同时也可以促进成纤维细胞的增殖；无血清培养时，雪旺细胞从离体坐骨神经迁出较含血清培养时更为明显；胎牛血清浓度为2.5%时，促进雪旺细胞增殖及抑制成纤维细胞的比值达到最高，为雪旺细胞纯化的最佳浓度。

3.2 基底膜浓度对雪旺细胞增殖的影响武雷等[21]通过用不同浓度的基底成分培养雪旺细胞发现，不同浓度的基底对雪旺细胞的增殖影响不同。当层粘连蛋白、纤维粘连蛋白和Ⅳ型胶原浓度分别为500 μg/ml、300 μg/ml、100 μg/ml时可发挥最大促增殖效应，并且随浓度的减低其促增殖效应减弱。

3.3 消化酶对雪旺细胞的影响李春雨等[22]分别用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶及两者混合酶消化乳鼠坐骨神经，并将获取的雪旺细胞传代培养，24 h后计数雪旺细胞。结果发现两者混合酶可较早出现雪旺细胞的增殖高峰，胰蛋白酶组出现最晚，并且两者分别对雪旺细胞有一定程度的损伤，当两者联合应用时可达到最佳消化效果。

3.4 高糖对雪旺细胞的影响目前关于高糖对雪旺细胞培养的增殖与否尚存争议，现有的文献对此有不同的结论。1998年Kuruvilla等[23]通过实验得出高糖对肿瘤源性雪旺细胞有增殖作用的结论。2003年Kamiya等[24]分别用高糖及低糖培养鼠雪旺细胞，结果高糖组与低糖组相比雪旺细胞的增殖明显受到抑制，此结论与2006年Wu等[25]对取源于新生大鼠坐骨神经雪旺细胞用高糖及低糖培养基培养结果一致。在上述文献中，Kuruvilla等[23]与Kamiya等[24]及Wu等[25]所用雪旺细胞的来源不同，这有可能是导致高糖引起雪旺细胞的增殖与否结论不一致的原因。高糖对雪旺细胞的影响尚需进一步证实。

3.5 吡咯喹啉醌对雪旺细胞的影响吡咯喹啉醌是一种葡萄糖脱氢酶辅基，能够促进细胞的增殖。为观察吡咯喹啉醌对雪旺细胞增殖及生长因子分泌的影响，贺斌等[26-27]在雪旺细胞培养基中加入吡咯喹啉醌发现，加入吡咯喹啉醌后雪旺细胞的形态由明显的尖对尖、并排的束状生长方式变为细胞数较少处为束状排列、细胞数较多处为簇状排列或圈状。当吡咯喹啉醌浓度在1～10 000 nmol/L之间时，可以促进雪旺细胞的增殖，同时使细胞的EGR1、EGR2及Sox10基因表达增高，浓度为100 nmol/L时促进表达能力最强，浓度大于10 000 nmol/L时对上述基因表达表现为抑制作用。

3.6 甲基泼尼松龙对雪旺细胞的影响蔡鸿敏等[28]于2008年为了研究甲基泼尼松龙对雪旺细胞增殖的影响，分别用0.1 mg/L、1.0 mg/L浓度的甲基泼尼松龙培养预变性7 d的兔坐骨神经组织块，并且用含胎牛血清的DMEM培养基作为空白对照，于传代培养后在相差显微镜下观察雪旺细胞的增殖情况，结果两组甲基泼尼松龙雪旺细胞增殖指数均较空白对照组高。同时使用流式细胞仪观察到处于S期的雪旺细胞甲基泼尼松龙组也较空白对照组百分比高，但两组不同浓度的甲基泼尼松龙之间无明显差别。

3.7 免疫抑制剂对雪旺细胞的影响Fansal等[29]在2000年用免疫抑制剂FK506培养雪旺细胞来观察其对雪旺细胞的影响，Fansa把FK506以每天100 μmol/L的剂量加入细胞培养基中，并且设立空白对照，连续培养7 d，同时应用激光扫描显微镜观察其中的变化，结果免疫抑制剂组与空白对照组相比雪旺细胞的数量明显增加，并且在第2天时雪旺细胞增殖后的数量是起初的一倍。FK506在促进雪旺细胞增殖的同时也抑制了成纤维细胞的增长，这种现象在第4天时尤为明显。同时还发现加有FK506的雪旺细胞胞内会出现一过性的Ca2+浓度升高，60 min后则会回到基础水平。根据Steiner等[30]增加细胞内Ca2+浓度可促进雪旺细胞增殖的理论，FK506则是通过增加胞内Ca2+来促进雪旺细胞的增殖。张振伟等[31]于2005年应用免疫抑制剂FK506培养雪旺细胞，也证实了Fansa FK506能够促进雪旺细胞增殖的结论。

4 结语

随着雪旺细胞培养方法的改进，雪旺细胞的纯度及数量较之前方法有了明显提高，但有些方法周期较长、费用较高。如何能设计出既简单又耗时短的方法，尚需进一步探索。

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Progress on the in vitro culture and purification of Schwann cells.

FU Hong-yun,WANG Rui-ying.Department of Orthopaedics,Guilin Medical University,Guilin 541000,Guangxi,CHINA

Schwann cells plays an important role in the peripheral nerve damage repair,which makes it become the most widely used cells in the field of neuroscience research.It is difficult to separate Schwann cells from fibroblasts in the extraction process,which causes high probability of Schwann cells being polluted by fibroblasts.So how to separate and obtain high pure Schwann cells is the researching focus.Now there are numerous methods of Schwann cells purification and culture.This paper just makes a summary on the recent technology of Schwann cells purification and culture from the domestic and foreign documents to provide certain reference for the purification and culture of Schwann cells.

Schwann cells;Culture in vitro;Purification

R329.2+1

A

1003—6350（2012）22—118—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.22.050

2012-04-22)

付红运（1987—），男，山东省济宁市人，在读硕士。E-mail：benqiang333@163.com

*通讯作者：王锐英，博士，副教授，研究生导师。E-mail:benqiang333@163.com