噬菌体生物扩增法在关节结核诊治中的临床应用研究

李 卓，刘晓艳，申 勇，吕翠环，刘丰胜，贾晨光

（1.河北省胸科医院骨科，河北石家庄050041；2.冀中能源峰峰集团邯郸医院外科，河北邯郸056200；3.河北医科大学第三医院脊柱外科，河北石家庄050051）

噬菌体生物扩增法在关节结核诊治中的临床应用研究

李 卓1，刘晓艳2，申 勇3，吕翠环1，刘丰胜1，贾晨光1

（1.河北省胸科医院骨科，河北石家庄050041；2.冀中能源峰峰集团邯郸医院外科，河北邯郸056200；3.河北医科大学第三医院脊柱外科，河北石家庄050051）

目的探讨噬菌体生物扩增法（Phage amPlified biologically assay，PhaB）快速检测关节结核脓液中结核分枝杆菌的临床应用价值。方法采用PhaB技术对关节结核患者36例，非结核性关节炎患者20例关节液中的结核分枝杆菌进行检测，同份标本同时进行涂片抗酸染色、罗氏培养。结果36例关节结核积液，PhaB阳性率为47.2%（17/36）、涂片抗酸染色阳性率为2.7%（1/36）、罗氏培养阳性率为5.5%（2/36）。20例非结核性关节炎患者PhaB、涂片抗酸染色、罗氏培养特异性均为100.0%。结论PhaB法检测关节积液中结核分枝杆菌只需2d，操作简便、灵敏度高、特异性强，不需要特殊仪器设备，可作为诊断关节结核的一种好方法。

结核，骨关节；分枝杆菌属；噬菌体扩增实验

细菌学方法检测关节液中结核分枝杆菌时间长，涂片阳性率低。近年来非结核分枝杆菌所致关节感染增加［1］，同时结核耐药菌增多，特别是耐多药结核菌的出现使得常规抗结核疗效不佳，因而，关节结核的病原学检测早期诊断及治疗显得尤为重要。对疑似耐药的病例，通常术前或术中获取标本，行结核分枝杆菌快速培养+药敏，或基因芯片快速诊断耐药，制定个体化化疗方案［2-3］。传统的分离培养结核分枝杆菌方法检出率虽然较高，但实验过程耗时较长。涂片法虽然时间短、价格低廉，但分辨不出活菌和死菌，而且检出率偏低，在临床工作中应用有一定困难。分子生物学新兴技术，包括基因芯片技术、聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术，费用较高，操作技术难度大，在基层医疗机构难于推广。噬菌体生物扩增法（PhageamPlified biologically assay，PhaB）以简便、快速、特异性高等特性，能快速准确地检出结核分枝杆菌，使关节结核病的快速早期诊断成为可能［4］。本研究将PhaB法技术应用于关节结核的临床诊治，早期检测其关节液中结核分枝杆菌，探讨研究该方法在关节结核早期诊断、药敏、治疗中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象：2009年5月—2011年2月在本院就诊的关节结核患者36例，男性24例，女性12例，年龄16～81岁，平均45.3岁。膝关节18例，肩关节3例，腕关节6例，踝关节3例，髋关节6例。所有患者均有长期（3个月～3年，平均1.3年）不同程度的膝关节肿胀、疼痛及活动受限。脓肿形成者，局部穿刺抽取脓液，常规留取关节液标本。另选取同期非结核性关节炎患者20例，男性12例，女性8例，年龄12～64岁，平均42.5岁。膝关节8例，髋关节6例，肩关节2例，腕关节2例，踝关节2例。患者均有长期（3个月～2年，平均1.2年）不同程度的膝关节肿胀、疼痛及活动受限，常规留取关节液标本。纳入标准如下。①根据病史、临床表现、影像学检查初步诊断。②根据彩色超声及影像学检查显示有关节积液形成。在无菌操作下关节穿刺抽取术前及术中积液，迅速送检，冷藏保存，及早检验，防杂菌污染、标本失效等。

1.2 实验方法

1.2.1 主要仪器及试剂：结核分枝杆菌噬菌体试剂盒（FastPlaque TB TM）由英国BiotecLaboratories Ltd公司生产，上海金浩科技发展有限公司提供。BACTEC MGIT-960全自动结核分枝杆菌培养系统，美国Becton Dickinson公司生产。改良罗氏培养基按《结核病诊断细菌学检验规程》［5］自配。

1.2.2 PhaB法：①试剂准备，按照试剂盒说明在无菌条件下配制所需试剂，包括培养基生长补充剂、敏感细胞溶液、琼脂和噬菌体等。②积液标本处理，将2mL积液标本与同体积4%NaOH加入50mL无菌有盖离心管中，漩涡振荡20～30s，充分消化混匀、室温孵育15min，再加培养基生长补充剂20mL，4 000r/min离心15min，弃去上清液后再加1mL培养基生长补充剂，重悬沉淀物（确保打散），用无菌吸管吸取0.1mL混悬液，转移至反应管中为备用待检菌液。③含菌培养基的制备，分别取0.1mL噬菌体溶液加入各反应管中充分混匀，37℃孵育1h后分别加入0.1mL杀病毒剂，充分混匀，置室温5min后各加1mL敏感细胞溶液和5mL培养基液，混匀后立即将冷却至（55±2）℃的5mL琼脂倒于各反应管颠倒混匀，内容物倒入无菌培养皿，室温定型后将培养皿放于37℃培养箱中培养18～24h。每次检测均同时设置阴性对照和阳性对照，阴性对照为无菌培养基生长补充剂，用于检测杀病毒剂的有效性。阳性对照为稀释16倍的敏感细菌溶液，用于检测噬菌体和敏感细胞的有效性。

1.2.3 抗酸染色和罗氏培养：同份关节液标本同时进行离心涂片抗酸染色镜检，改良罗氏培养，操作方法按《结核病诊断细菌学检验规程》［5］执行。

1.3 结果判读：按试剂盒说明。实验组，阴性结果≤19个噬菌斑，阳性结果≥20个噬菌斑。对照组，阴性对照≤10个噬菌斑，阳性对照≥20个噬菌斑。

1.4 统计学方法：应用PEMS3.1软件进行统计学处理，计数资料以百分率表示，不同检测方法比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

3种方法对36例关节结核患者阳性率分别为PhaB法52.7%（19/36）、抗酸染色8.3%（3/36）、罗氏培养30.5%（11/36），PhaB法阳性检测率明显高于涂片和罗氏培养，差异有统计学意义（χ2= 38.725、35.821，均P＜0.01）。检测20例非结核性关节炎患者的PhaB法、抗酸染色、罗氏培养特异性均为100.0%。

3 讨 论

关节结核是临床上较常见的疾患，常发生于少年和儿童，以髋关节和膝关节多见，肘关节、腕关节、踝关节次之。分原发性和继发性，原发性病灶首先累及滑膜称为滑膜型结核，后者由骨关节端结核病灶蔓延扩散所致，称为骨型。关节结核是结核分枝杆菌对关节的滑膜、骨及软骨感染、破坏为主的一系列病理过程。本病以继发感染为主，多继发于肺结核［6］，由肺部病变后血运转移至骨关节发病。患者肺部病变多已吸收、纤维化或钙化。原发病灶形成多在幼年时期，结核分枝杆菌生长缓慢，通过原发病灶进入血运，随血行到达骨与关节组织中，机体免疫系统可杀灭绝大部分，少数未被消灭的结核分枝杆菌如没有适宜的生长环境，则长期潜伏，处于静止或休眠状态，在机体的免疫力及抵抗力降低或其他不利因素的影响下，结核分枝杆菌迅速大量繁殖，突破包围的纤维组织结构，其数量和毒性较前增加，产生液化、增殖及干酪坏死病变，炎症扩大，产生局部症状和全身结核中毒反应导致发病，关节结核由此产生。关节结核缺少特异性的临床表现，临床对初诊患者确定诊断的难度较大，误诊率高，延误治疗导致关节功能丧失。长期应用的细菌学方法检测关节液中结核分枝杆菌涂片耗时较长，且阳性率低。结核分枝杆菌分离培养方法是一种传统的检测方法，临床应用中阳性率较高，但过程费时较长。涂片法速度快、价格低廉，但在活菌和死菌上不能分辨，而且细菌检出率较差，无法在临床中应用。PhaB技术是Wilson等［7］于1997年建立的一种快速检测结核分枝杆菌技术，基本原理是结核分枝杆菌与噬菌体混合孵育时，噬菌体感染结核分枝杆菌，随后加入杀病毒剂杀死未感染的噬菌体，而菌体内的噬菌体不受影响。感染的噬菌体在靶菌体内繁殖并裂解释放子代噬菌体，这些噬菌体又感染和裂解随后加入的敏感细胞（耻垢分枝杆菌，快速生长型分枝杆菌），在琼脂培养基上形成噬菌斑。因此，可根据噬菌斑的有无判断标本中是否存在活的分枝杆菌［8］。噬菌体和敏感细胞快速的生长繁殖，结果在18～24h内就可观测出来，结核分枝杆菌可以被可靠、迅速地检验，并且可以鉴别其是否为活体细菌，这对关节结核的早期临床诊断和指导抗结核药物治疗具有重要价值及意义。

本实验显示，PhaB法检测结核性关节积液中结核分枝杆菌的阳性率为52.7%，明显优于传统的涂片找抗酸菌8.3%和罗氏培养30.5%；特异性为100.0%。表明PhaB检测的优越性［9-10］。目前，临床诊断结核病的检验法有很多种，结核分枝杆菌抗酸染色是当前最广泛的应用检测之一，该检测方法价格低廉，速度快，简单易行，便于推广，对于含菌量较高的样本检出率高，但对含菌量较低的腹腔积液、胸腔积液及关节液等样本检出率明显减低，不能达到早期诊断结核病的目的。罗氏培养法的阳性率虽然较涂片法高，但不能快速诊断及明确药物敏感性，对临床上需要早期诊断并应用敏感抗结核药物的要求不能满足。实验过程中注意事项：①严格在无菌原则下抽取关节积液，装入无菌的容器内，冷藏保存，防止其他杂菌污染等；②消化液选择4%NaOH，根据积液的稀稠度及是否含有干酪样坏死物，应当增加消化的时间以确保效果；③为避免杀死噬菌体，浇注时琼脂的温度不应过高，控制在（55±2）℃；④实验过程严格遵守无菌原则，以免出现假阳性结果；⑤与少数几种非结核分枝杆菌有交叉反应，有文献［11］报道与耻垢分枝杆菌、金色分枝杆菌、偶然分枝杆菌、草分枝杆菌会出现阳性或弱阳性反应，从而造成假阳性；⑥影响实验准确因素复杂，药物的浓度和作用温度、作用时间、浇注平板时的琼脂温度以及杀毒剂浓度和混匀情况等都可以对检测结果的准确性造成影响。

在临床中关节结核早期与滑膜炎及关节炎不易鉴别，常延误治疗，对关节功能造成严重后果。PhaB作为检测结核分枝杆菌的一项新方法，在结核病的临床研究及诊治中具有重要的作用。PhaB已经成熟应用在结核病的早期快速诊断、治疗等各方面，目前常用于肺部结核诊断治疗。本研究表明PhaB在关节结核中的应用是可靠并切实可行的，其简便、经济、快速，并具有较高敏感性和特异性的优点，对关节结核的早期诊断、治疗、保护关节功能具有重要意义。

［1］吴启秋.林羽.骨与关节结核［M］.北京：人民卫生出版社，2006：36-37.

［2］张泽华，万东勇，许建中，等.结核分枝杆菌快速培养和常规药敏在脊柱结核治疗中的应用［J］.中华骨科杂志，2008，28（12）：988-991.

［3］张泽华，罗飞，吴铮，等.基因芯片早期诊断脊柱结核耐药［J］.中华检验医学杂志，2010，33（11）：1-4.

［4］MOLER RJ，MASKELL T.Phage as a diagnostic the use of Phage in TB diagnosis［J］.J Chem Technol Biotechnol，2001，76（7）：683-688.

［5］中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程［J］.中国防痨杂志，1996，18（1）：28-31.

［6］天津医院骨科.临床骨科学［M］.北京：人民卫生出版社，1974：16-18.

［7］WILSON SM，SUWAIDI Z，MCNEMEY R，et al.Evaluation of a new raPid bacterioPhage based method for the drug suscePtibility testing of Mycobacterium tuberculosis［J］.Nat Med，1997，34（4）：465-468.

［8］靳安佳.噬菌体生物扩增法检测肺结核患者痰标本临床应用研究［J］.中华检验医学杂志，2005，28（8）：807-808.

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［11］周劲松，陈建庭，吴雪琼，等.BACTEC MGIT2960培养及分子菌种鉴定技术在脊柱结核诊断中的应用［J］.第一军医大学学报，2002，22（9）：830-832.

（本文编辑：赵丽洁）

EXPERIMENTAL STUDY OF RAPID DETECTION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS IN JOINT FLUID BY PHAGE AMPLIFIED BIOLOGICALLY ASSAY

LI Zhuo1，LIU Xiaoyan2，SHEN Yong3，LV Cuihuan1，LIU Fengsheng1，JIA Chenguang1
（1.Department of Orthopedics，the Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China；2.Department of Surgery，the Jizhongnengyuan Handan Hospital，Handan 056200，China；3.Department of Spinal Surgery，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050019，China）

ObjectiveTo evaluate the clinical value of Phage amPlified biologically（PhaB）assay to detect mycobacterium tuberclosis in joint fluid.MethodsThe joint fluid samPles，from 36 Patients with joint tuberculosis and 20 Patients without joint tuberculosis，were detected by PhaB assay. ReSultS The Positive rate of PhaB assay in 36 Patients with joint tuberculosis was 47.2%（17/36），those of smear and culture were 2.7%（1/36）and 5.5%（2/36）resPectively.Twenty samPles without joint tuberculosis were all negative by above three methods.ConclusionThe exPerimental Procedure of PhaB assay costs only 2 days，and it is a simPle，highly sensitive and sPecific method for the diagnosis of joint tuberculosis.

tuberculosis，osteoarticular；mycobacterium；Phage amPlified biologically assay

R529.2

A

1007-3205（2012）05-0525-03

2012-02-28；

2012-05-09

河北省医学科学研究重点课题计划（20090262）

李卓（1975-），男，河北隆尧人，河北省胸科医院主治医师，医学硕士，从事骨科疾病诊治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.05.012