细菌鉴定的分子生物学方法*

赵鎏莉，王晓萍

(哈尔滨师范大学)

0 引言

自然界中，分布最广、数量最多的有机体是细菌.它的代谢类型繁多，具有超强的适应力，能以有机物为碳源、氮源，将其充分降解为无机物.利用细菌的生产，快速、安全、成本低.目前，细菌已广泛应用于生态环境的修复、工农业的生产、食品制造等领域.这几年，发达国家正在努力完善细菌发电技术.不久之前，英美科学家首次精确地展示了细菌中运送电荷的细胞内蛋白质分子结构［1］.但是致病菌也无时无刻不在危害着环境中其他生物包括人类的健康.传统的鉴定方法很难鉴定出种属之间有相似生理生化特性的细菌，而且鉴定时间长并且需要使用大量的药品.随着分子生物学的不断发展，研究人员建立了多种完善的分子生物学鉴定方法.它们可以准确、快速的对微生物进行鉴定，而且大大降低了鉴定成本.因而对细菌的鉴定方法的总结显得十分重要.目前国内尚未集中介绍常用的分子生物学鉴定方法和最新的分子生物学鉴定方法的研究.笔者将对常用的细菌鉴定方法:基因序列同源性分析鉴定法、基于PCR的指纹图谱鉴定法、核酸杂交鉴定法和一些应用于细菌鉴定的最新的分子生物学方法进行总结，希望能为国内的细菌鉴定工作者提供参考.

1 基因序列同源性分析鉴定法

基因序列的同源性分析是一种PCR技术与测序技术相结合的方法.测序的结果通过与BLAST中已知的序列的比对，分析出同源性，达到鉴定的目的.聚合酶链式反应PCR(Polymerase Chain Reaction)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，最早是Khorana于1971年提出的设想.美国科学家Kary Mullis等在1985年实现了这一梦想，发明了对生物学发展具有强大推动力的 PCR技术［2］.它的原理类似于自然界中DNA复制过程，它的特异性来源于与靶序列两端互补的引物.测序技术从70年代末发展至今，已经有化学修饰法、Sanger双脱氧链末端终止法、高通量测序技术、MPSS和454焦磷酸测序等多种方法.但目前应用最多的还是双脱氧链末端终止法和化学降解法.

1.1 16s rDNA基因序列同源性分析

它是目前应用最为广泛，也是最早应用到细菌鉴定的分子生物学方法.细菌的16s rDNA在细菌的进化中具有高度的保守性，被认为是细菌分子的“活化石”.但也存在着九到十个变异区，使得不同种属的细菌间有着一定的差异.这也就成了细菌分类的标志.目前，几乎所有已知细菌的16s rDNA序列都已经被测定，并被载入基因库.

16s rDNA基因序列同源性分析的过程分为:(1)16s rDNA的提取;(2)选择通用引物或设计特异性引物，进行 PCR;(3)测序;(4)与BLAST中已有序列进行比对.但是由于需要对16s rDNA的全序列进行测序，所以测序周期长，测序费用高.

1.2 16～23 s rDNA基因序列同源性分析

由于16 s rDNA的高度保守，所以很难分辨出相近种或同一种内的不同菌株.16～23 s rDNA间隔区(ITS)是位于16 s rDNA与23s rDNA之间的区间序列.它的进化速度是16 s rDNA的10倍，该区间经常有序列的缺失和插入，造成不同种和同种不同菌株的16～23 s rDNA间隔区(ITS)在数目、长度和序列组成上的差异性［3］.所以这些年来，也受到广泛的关注.ITS区的分析方法与16 s rDNA一样，引物则根据16 s rDNA的下游和23 s rDNA的上游的保守区设计.Anu Tilsala等人首先利用这种方法，来对菌株进行鉴定，目前在临床和流行病学上应用非常广泛［4］.

2 基于PCR的指纹谱图鉴定法

2.1 PCR-RFLP/T-RFLP

限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析是最早以DNA指纹图谱为基础的微生物鉴定方法.它是用限制性内切酶对细菌基因组DNA进行切割，然后通过电泳分离，利用指纹图谱来检测基因组中限制性内切酶酶切位点的变化，从而比较出不同基因组之间的核苷酸差异，以显示不同菌种基因组DNA的限制性片段长度多态性.它用于细菌种间及种内株间的分型鉴定［5］.

由于RFLP产生的DNA指纹图谱的复杂性，在分析菌群时费时费力，且需要克隆基因探针，而且对DNA的量和纯度有很高的要求，所以此技术经常与PCR技术结合，即PCR-RFLP技术.此技术可简化图谱的带型，易于分析.

该技术的步骤为:(1)提取DNA;(2)根据rDNA的保守区设计引物;(3)有选择性的PCR;(4)用适当的限制性内切酶对PCR产物进行酶切;(5)用琼脂糖凝胶电泳进行分离，产生限制性片段;(5)进行指纹图谱分析，根据片段的大小、标记片段种类和数量的不同，对细菌经行鉴定.

张旋等人检测了204份体液标本，结果与培养法相比，其灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为 95.7%、88.6%、88.0% 和99.4%［6］.说明 PCR-RFLP 在菌种鉴定中具有高特异性、高敏感性、快速性、准确性等特点.近些年来，PCR-RFLP已经广泛的应用到了细菌的鉴定中［7-9］.

末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)是用荧光染料对PCR引物的5＇端进行标记，再用适当的限制性内切酶消化PCR产物，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳分离，再用荧光检测仪对标记片段的大小、种类和数量进行检测，最后用Gene Scan软件进行分析.该方法降低了图谱的复杂性，使得结果易于分析，重复性好.Thies FL等人利用此法鉴定出1个属的23个种的细菌［10］.T-RFLP不仅可对已知菌进行鉴定，还能发现未知菌.

2.2 随机扩增DNA多态性

随机扩增DNA多态性(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)又称随机引物 PCR.RAPD是建立于PCR基础之上的分子标记技术，基本原理是利用一个随机引物(8～10个碱基)通过PCR非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究［11］.这样就发现了菌种之间DNA的变异片段数量和大小的不同.RAPD技术不仅可以在种间、亚种间甚至还能在同一亚种的不同菌株间进行鉴别.而且还能应用于未知菌株快速鉴定和流行病学调查.Kullen等人采用RAPD对分离于人体内的各种双歧杆菌进行鉴别［12］.国内方面，邓海平等人对甘肃地区牛源金黄色葡萄球菌进行了RAPD 分型［13］.

该技术的步骤为:(1)细菌基因组DNA提取;(2)PCR引物选择或设计;(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物;(4)指纹谱图分析.

由于RAPD使用的是随机引物，而且引物具有通用性，这可以极大地减少费用和节省时间，所以可以应用于大规模生产和商品化.另外RAPD技术容易操作，检测周期短，且反应程序可以实现自动化.因而，在大规模生产中，RAPD的优越性是无可比拟的.

2.3 扩增片段长度多态性

扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)，也称限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment amplification，SRFA).AFLP利用两种以上的酶，一种是常用切割酶，一种是罕见切割酶，切割后的DNA形成不同的限制酶切片段.然后在得到的酶切片段上加人工接头，以其作为模板进行扩增.对引物修饰后，实现了选择性扩增，使一个样本出现特定的DNA带谱，而另一个样本可能无此带谱.扩增产物经变形聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，就显示出了扩增片段长度多态性.它兼具了RAPD和RFLP的优点，有比较高的稳定性，而且AFLP标记比RFLP、RAPD标记更为可靠，可有效地揭示微生物多态性.使得研究人员不仅可以利用它鉴别微生物不同属的物种，甚至还可以鉴别出同一种属，不同菌株间的差异.Hopkins KL等人采用荧光素标记，即荧光素标记的扩增片段长度多态性，已经鉴定出尿路菌、大肠埃希菌、空肠弯曲菌和不动杆菌［14］.在国内，AFLP已经广泛的应用到酿酒菌的鉴定和生产过程的监控中［15-16］.

该技术的步骤为:(1)DNA的提取及纯化;(2)DNA的修饰及模板的制备;(3)AFLP反应;(4)PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析;(5)放射自显影及分析.

2.4 PCR-SSCP

PCR-SSCP，即 SSCP(Single Stranded Conformation Polymophism，单链构象多态性)与PCR结合分析.DNA单链构象具有多态性，碱基序列的不同，影响了其空间构象.因此在电泳上的迁移率也不同.SSCP可将长度相同但碱基排列不同的片段区分开.该方法灵敏度极高，能检测到一个碱基的差异.由于PCR-SSCP技术的灵敏快速、操作简便等优点，国内外很多研究人员将其应用于细菌、真菌等多种微生物的鉴定研究中，并得到了很好的效果［17］.

该技术的步骤为:(1)DNA的提取及纯化;(2)PCR扩增;(3)先将特异的PCR扩增产物变性，再迅速复性，成为具有一定空间结构的单链DNA分子;(4)用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对单链DNA分子进行分离(5)放射自显影及分析.

3 核酸杂交鉴定法

利用碱基互不配对原理，人工的对两条不同来源的单链核酸进行复性，构建出新的杂交双链.用这种方法可以进行DNA-DNA，DNA-rRNA，rRNA-rRNA分子间的杂交.核酸杂交是测定核酸分子同源性程度和不同物种亲缘关系的有效手段.

3.1 DNA-DNA/DNA-rRNA 杂交

DNA-DNA分子杂交的方法很多，常用的是直接法.就是把待测菌株的双链DNA先解链成单链DNA，把它固定在硝酸纤维素滤膜或者琼脂等固相支持物上，然后把它放入含有经同位素标记的、酶切并解链过的参照菌株的单链DNA液中.在适宜的条件下，在膜上复性，构建成杂交双链DNA.通过检测杂合DNA的放射性强度，计算出被测组与参照组的相对放射强度值，即同源性或相似性强度.DNA-DNA杂交可以在种和属的层次上鉴定细菌.但如果两株菌的关系比较远，它们的DNA不能杂交，这就要研究它们RNA的碱基序列相似性.Deleg等用十几年时间，用DNA-rRNA杂交方法研究了数千株不同科属的400多种菌［18］.Denis Roy等人用这种方法对73株乳酸菌进行了鉴定，并确定了它们的亲缘关系［19］.

3.2 荧光原位杂交技术

荧光原位杂交(FISH)技术是根据已知微生物在不同分类层次上种群特异的DNA序列，以荧光标记的特异寡聚核苷酸片段为探针，与环境基因组中的DNA杂交，对环境中特定微生物种群进行鉴定、数量分析及特异微生物的跟踪等.

4 其他技术

多位点序列分析技术(MLSA).在现代技术中，研究人员常扩增一些编码特定蛋白的基因来进行菌属中种的鉴定.MLSA技术主要应用的是rpoA基因和 pheS基因［20］，它们分别负责编码RNA聚合酶α-亚基和苯丙氨酰-tRNA合成酶的.通过PCR，对PCR产物进行序列分析，采用软件分析或者进行GC含量分析来确定细菌种属［21］.

除了rpoA基因和pheS基因两种常用的基因以外，pmoA和mxaF等编码结构和功能蛋白质的基因可以应用到该方法中来对细菌进行鉴定.

5 小结与展望

细菌在自然环境、人类生活和科学技术研究中占有举足轻重的地位，然而我们对它认识还相对较少.随着分子生物学的不断进步，会有越来越多的细菌分子生物学鉴定方法建立起来.分子生物学手段和传统方法的结合将为细菌鉴定提供更加准确、快速、有效的保障，这将极大地为细菌的研究提供基础.

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