邻、间、对双胍基苯甲酸盐酸盐抗菌活性的研究

2012-04-01金绍娣

化工技术与开发 2012年10期

金绍娣

（盐城纺织职业技术学院化学工程系，江苏盐城 224005）

降血糖药物二甲双胍、杀菌剂双胍氯己啶、双胍辛醋酸盐以及衍生物在农业和医药领域显示较高的抗菌和杀菌的生物活性[1~2]，通过双胍基的活性基团与生物体中的某些特定基团或元素作用，使生物体正常的物质和能量代谢发生改变。近年来双胍的合成方法[3~5]不断出现，而胺类与双氰胺加成反应制备芳基类双胍是一种较为简单的好方法，原料易得，操作简单，对试剂和仪器要求较低。本文以氨基苯甲酸为起始原料，合成了3种不同取代位置的双胍基苯甲酸盐酸盐，并探讨了其对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抑菌能力。

1 实验部分

1.1 主要试剂和仪器

邻、间、对双胍基苯甲酸盐酸盐（自制）。

菌种：大肠杆菌 E.coli（ATCC 25922），金黄色葡萄球菌S.aureus（ATCC 6538）由盐城工学院化学与生物工程学院提供。

1.3 实验方法

1.3.1 邻、间、对双胍基苯甲酸盐酸盐的制备

参照文献[6]进行制备。

1.3.2 最低抑菌浓度（MIC）测试

用接种环轻轻划取一环菌种菌落至50mL营养肉汤(蛋白胨0.5g，氯化钠0.25g，牛肉膏0.15g，去离子水50mL，pH6.8±0.1）中，于37℃全温摇瓶柜上120r·min-1培养至OD600值为0.5，以备抗菌测试。分别配制o、m、p-CPBGH水溶液，121℃高温灭菌20min后，用2倍稀释法溶于高温灭菌后的营养肉汤中，分别配制最终浓度为256μg·mL-1、128μg·mL-1、64μg·mL-1、32μg·mL-1、16μg·mL-1、8μg·mL-1、4μg·mL-1、2μg·mL-1、1μg·mL-1、0μg·mL-1的溶液置于 10 支无菌试管中，取0.1mL OD600值为0.5的菌悬液于10mL上述各个浓度样品中，震荡均匀后置37℃全温摇瓶柜中振荡培养24h，根据比浊法原理，用分光光度计测定OD值得最低抑菌浓度（MIC）。每一个菌种每一质量浓度的样品溶液平行做2次，绘制邻、间、对双胍基苯甲酸盐酸盐对E.coli和S.aureus的生长抑制曲线。

2 结果与讨论

菌体接种到新鲜空白的液体培养基中后，开始并不是立即就繁殖，即表现出培养基吸光度值的增加。该阶段主要是调节菌体体内代谢酶系，以适应新的环境。培养基中加入抗菌剂后，抗菌剂就会干扰微生物的体内代谢活动。抗菌剂浓度低时，增加微生物自我调节的时间，直到抗菌剂被菌体体内酶系代谢，或微生物自身酶系发生改变，产生了一定抗药性才会生长。抗菌剂浓度足够高时，有可能会彻底破坏微生物的生命活动，对微生物起到杀灭作用。因此，从菌体生长曲线的变化可看出抗菌剂对微生物抑菌能力的强弱、大小。

图1和图2分别为o,m,p-CPBGH对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌生长抑制曲线。

图1 o,m,p-CPBGH对大肠杆菌生长抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of o,m,p-CPBGH on growth curve of E. coli

图2 o,m,p-CPBGH对金黄色葡萄球菌生长抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of o,m,p-CPBGH on growth curve of S.aureus

结合图1 的o，m，p-CPBGH对大肠杆菌生长抑制曲线可以看出，添加o，m，p-CPBGH后的大肠杆菌在相同时间内繁殖的代数有所减少，从而在一定程度上抑制了大肠杆菌的生长。大肠杆菌在o，m，p-CPBGH溶液中培养后开始繁殖，吸光度增大，14h后添加o-CPBGH后的大肠杆菌生长曲线表现出明显的抑菌能力，吸光度较低且稳定，这可能是由于o-CPBGH易于形成六元环的螯合物，螯合细菌蛋白酶中金属离子，破坏了菌体的新陈代谢；而添加m，p-CPBGH的大肠杆菌与空白相比，也有较好的抑菌效果。

由图2的金黄色葡萄球菌生长抑制曲线可以看出，o，m，p-CPBGH的存在抑制金黄色葡萄球菌的生长，且抑菌效果优于空白溶液。金黄色葡萄球菌在o，m，p-CPBGH溶液中培养后开始繁殖，吸光度增大，很明显添加o-CPBGH后的金黄色葡萄球菌生长曲线表现出明显的抑菌能力，培养14h后吸光度处于较低的值且稳定；而添加m，p-CPBGH后的金黄色葡萄球菌与空白相比，也都有较好的抑菌效果。

表1 o，m，p-CPBGH抗菌活性的比较Table1 The antibacterial activities of o，m，p-CPBG

由表1可以看出o-CPBGH对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为0.064mg·mL-1和0.032mg·mL-1，m-CPBGH对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为0.128mg·mL-1和0.064mg·mL-1，p-CPBGH对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为0.128 mg·mL-1和0.064 mg·mL-1。双胍可以通过絮凝作用凝固菌体的蛋白质、磷壁酸、脂多糖，破坏菌细胞膜的渗透屏障，导致细菌的完整性破坏，营养物质流失，达到抗菌的效果；或吸附带有负电荷的细菌，干扰细胞壁的合成，使细胞壁溶解而死亡。邻位双胍的抑菌能力是间位和对位的2倍，邻位双胍基苯甲酸盐酸盐可能更易于形成六元环的螯合物，螯合细菌蛋白酶中金属离子，影响细菌对营养物质的吸收，导致菌体新陈代谢的紊乱，从而在杀菌和抑菌的能力方面要比间位和对位双胍基苯甲酸盐酸盐所形成的相对不稳定的七元环和八元环螯合物更强一些。