妇科病证结合动物模型的研究

2012-04-01俞丕超张建伟

长春中医药大学学报 2012年3期

俞丕超，张建伟

(1.山东中医药大学，山东济南 250355；2.山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心，山东济南 250011)

在妇科领域中，各种疾病发病机制及各种新的治疗方法的研究在很大程度上依赖于动物实验研究。随着妇科疾病的发生、发展，病证结合动物模型成为重要的实验方法和手段。目前妇科病证结合动物模型的研究主要涉及月经病、妇科杂病等，将病和证紧密的结合，更好地模拟临床状态。

1 妇科病证结合模型的造模方法

1.1 复合因素建立妇科病证结合模型该方法是指在中医药理论的指导下，结合现代医学理论与实验动物科学知识，分别(或同时)采用传统中医学病因复制证候动物模型和现代医学病因复制疾病模型，使模型动物同时具有疾病和证候特征。

1.1.1 肝郁血瘀型宫环出血病证结合大鼠模型李慧[1]选用体质量(280±300)g SD雌性大白鼠，已育未孕，采用秦大莲等[2]的造模方法略加改进，通过手术将改造后的IUD固定于右侧子宫壁上，手术7 d后，参照高萧枫等[3]的方法结合孤养造成肝郁模型，将大鼠单笼孤养，用细纱条束缚四肢，使其正常生存本能受阻而不能表达，导致肝疏泄不及，形成一种“郁怒”状态，持续时间从第1天的4 h逐渐增至每天6 h，连续28 d。自造模第22天开始予宫环止血Ⅰ号(香附10 g，白芍10 g，三七3 g，炒蒲黄10 g，马鞭草12 g，仙鹤草10 g，女贞子10 g，旱莲草10 g。经80 ℃水浴蒸发浓缩成含生药1.5 g/mL的浓缩药液，置4 ℃冷藏备用)按0.665 g/100(g·d)灌胃，共计7 d。以大鼠的体质量、蔗糖水摄入量以及行为学指标的变化作为观察指标，并应用抗体芯片技术测量动物模型子宫组织细胞因子水平。造模成功后大鼠表现出饮食、活动减少，喜欢贴壁、叫声尖细、胡须下垂、反应迟缓等情志和行为的改变，符合肝郁证动物模型的症状[4-5]。体质量增长缓慢，蔗糖摄入率降低，提示肝郁大鼠模型快感缺乏，对奖赏刺激兴趣缺失，药物治疗后以上症状均得到缓解。子宫组织细胞因子中睫状神经营养因子(CNTF)显着降低，白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)显著升高，而治疗药物可逆转这种表达，甚至使其接近正常水平。

1.1.2 气虚血瘀证卵巢癌大鼠模型张勤华等[6]选用清洁级Wistar雌性大鼠，体质量100～120 g，4～6周龄。手术将致癌剂二甲基苯蒽(DMBA)药线埋入大鼠卵巢内，术后将大鼠放回笼中饲养[7]。正常饮食+大黄芒硝合剂(大黄煎煮去渣，与芒硝按照4：1的比例浓缩成含生药1.5 g/mL的药液备用，药量按成人每kg体质量的20倍计量)灌胃2 mL/隔日×4周，共8周。观察大鼠的毛发、饮食、排泄、活动等情况。每周测量大鼠体质量，绘制体质量增长曲线。造模成功后大鼠体质量增长缓慢、肿瘤出现提前、腹水发生增加。35周全部处死剖腹探查。比较平均成瘤时间，肿瘤发生率、转移及腹水发生率，35周之前死亡的当即剖腹探查。在灌胃2、4、8周分别取大鼠尾静脉血，制成涂片，用图像分析仪测出30个T淋巴细胞核仁银染强度的平均值，用核仁银染面积(S核仁)与细胞核面积(S核)的比值来表示。同时取0.5 mL血，按照郭峰[8]红细胞免疫黏附酵母菌花环法，以红细胞结上1个或以上酵母菌算1个花环，计数100个红细胞的花环率。崔英等[9]证实，卵巢癌患者出现继发性红细胞免疫功能降低。造模后大鼠红细胞C3b受体花环率显着降低，从而验证了模型的成功。

1.1.3 更年期综合征阴虚内热证大鼠模型胡随瑜等[10]选用(162.4±2.3)gWistar雌性大鼠，手术摘除大鼠的卵巢，术后第4、5、6、7天逐只进行阴道涂片检查，以确定卵巢摘除完全。术后第8天，开始灌服热性中药(制附片25 g和干姜25 g等量水煎煮成含生药浓度为50%，按剂量20 mL/kg灌胃)，连续灌服14 d。停止造模后第10天，模型大鼠血清E2的水平下降，LH、FSH的水平上升，子宫重量减轻，并且出现血浆NE、E、脑组织5-HT值升高、体质量增长缓慢、舌尖色红、饮水量增加、肛温上升等阴虚内热证[11]。在末次灌服热性中药24 h后，开始治疗性给药，灌服地贞颗粒9 d后,大鼠神经内分泌的紊乱和阴虚内热的症状明显改善，则造模成功。

1.1.4 肾虚血瘀型子宫内膜异位症模型冉青珍等[12]选用体质量200 g雌性SD大鼠，3月龄。每日进行阴道细胞涂片检查，选择动情周期[13]4～5 d者为合格动物。在肾虚血瘀证模型的基础上按西医“自体移植法”造子宫内膜异位症疾病模型[14]。造模成功后大鼠被毛蓬松、硬、凌乱，拱背少动、扎堆怕冷、大便稀溏等。舌质绛紫黯淡；尾部自尖至根出现不同程度皮下瘀紫或青斑、眼球转为黯红；后肢行动艰难迟缓等肾虚与血瘀的临床表现。血液流变学各项指标明显升高，即血液呈“黏滞”状态，符合中医“血瘀”微观状态。

1.2 单一因素建立妇科病证结合模型该方法是指使用单一因素作为病证结合模型疾病与证候共同的造模因素。

1.2.1 经前期综合征肝气郁证大鼠模型宋洪运[15]选用健康SD雌性大鼠,体质量180～220 g。按阴道涂片镜检法观察大鼠各期细胞形态及数量，确定动情周期，选取处于动情后期的大鼠纳入实验。参照文献[16]方法束缚造模，将拟造模大鼠前足与对侧后足用无菌纱布捆缚，妨碍其自由活动，同时造模笼中放入自由活动大鼠以增强致郁效应。造模同时每日给经前舒颗粒(10 g/kg，相当于人临床8倍剂量)，造模完成后即进行旷场实验测定相关行为学指标[17]，随后处死。断头取血，以放射免疫法测定血清E2、FSH、LH含量。造模后旷场实验得分显著减少，提示大鼠活动量明显减少，兴奋性降低，大鼠行为表情结果则不活跃，精神萎靡，眼神呆滞，相互扎堆睡觉，对外界刺激不敏感。E2水平下降，FSH水平显著上升，LH无明显变化，F/L比增大，提示大鼠存在卵巢功能衰退的生理变化。而给予经前舒颗粒干预后，肝郁症状缓解，相关指标得到恢复或改善。

1.2.2 肾阳虚排卵障碍大鼠模型时思光[18]选用体质量(220±10)g SD雌性大白鼠，未孕未产，10～12周龄，每日下肢肌注氢化可的松注射液36 mg/kg，连续11 d。给药第5天起，造模大鼠逐渐出现一系列“肾阳虚”的表现,给药11 d后将造模大鼠开腹，腹主静脉取血，测定血清E2、FSH、LH水平均明显降低，取子宫、卵巢，显微光镜下组织形态学及超显微结构检查，病理改变提示为排卵抑制，造模后大鼠阴道涂片周期性变化消失，符合肾虚排卵障碍的证候与病理特征，则造模成功。

1.2.3 肾虚黄体抑制流产病证结合动物模型宁艳等[19]选用健康、未产、10～12周龄、体质量约200～250 g的SD大鼠，参照周莉等[20-21]的报道，采用羟基脲和米非司酮造模。按雌、雄为2∶1合笼，置于18～24 ℃动物房中喂养。每日晨阴道涂片，以发现大量精子日作为妊娠第1天。从妊娠第1天到第10天灌服羟基脲(450 mg/kg)造成黄体抑制模型，第11天灌服米非司酮(3.75 mg/kg)，第12天将大鼠麻醉后解剖，剪取子宫称重，记录胚胎数和流产数，0、10、11、12 d 均取血液样本，-20℃保存血清，测定自由基过氧化物歧化酶(SOD)，观察妊娠大鼠子宫内胚胎发育和流产情况。妊娠大鼠均于造模后几天出现纳食减少、活动减少、反应迟钝、毛色干枯等症状，体质量明显下降，SOD明显降低[22]。研究[23]提示自由基含量可作为肾虚证的辨证指标之一。造模后胚胎着床数减少。

2 问题与展望

综合近年来妇科病证结合动物模型的研究，存在以下问题：1)目前主要局限于月经病的研究，辨证分型尚缺少系统研究，局限于肝郁、肾虚。2)模型制备上，多为疾病动物模型与中医证候动物模型嫁接，需创建符合妇科疾病特点的病证结合动物模型并使之规范化。3)以证候为内容的模型评价体系尚不健全，血瘀、气滞、湿热、脾虚、阴虚等这些辨证类型的标准尚无统一定论。今后的研究方向：1)中医妇科学在临床应用中的突出特色与优势在于调经、助孕、安胎、治疗带下病、产后病及杂病等。因此除月经病应开展更多其他妇科疾病的病证结合研究，如妊娠病、产时病、产后病、妇科杂病、前阴病等。从而为临床工作奠定基础。2)妇女“以血为本，以气为用”。月经、胎孕、产育、哺乳都是以血为用，血为气之配，血病则气不能独化，气病则血行不畅。故模型制备方法上，应结合妇科的生理病理特点，在西医疾病模型的基础上，不施加人为干预因素，在疾病模型建立过程中或建成后，观察并检测疾病模型所表现的中医证型(如阴阳、虚实、寒热等)，从而更好地体现妇科疾病中医“证”的阶段性、动态性。3)对证候的评价标准除模型动物的宏观体征、行为表现及与证候相关的个别理化指标，应增加以方测证的评价标准，选用治疗妇科疾病的古方、效方对所建立的模型进行证实，以方证相应、方证相佐理论验证所建立模型的可靠性。随着中医学研究的不断深入及多学科的参与，相信妇科病证结合动物模型将会得到进一步提高和发展，从而更好地指导临床。

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