镰刀菌属遗传多样性的ISSR分析

王献慧，魏林，梁志怀，陈玉荣，张屹

（1.中南大学研究生院隆平分院，湖南长沙，410125；2.湖南省植物保护研究所；3.湖南省西瓜甜瓜研究所）

镰刀菌属遗传多样性的ISSR分析

王献慧1，2，魏林2，梁志怀3，陈玉荣2，张屹1，2

（1.中南大学研究生院隆平分院，湖南长沙，410125；2.湖南省植物保护研究所；3.湖南省西瓜甜瓜研究所）

对运用分子生物学手段研究镰刀菌属的遗传多样性进展进行了综述，并对ISSR分子标记技术在镰刀菌属遗传多样性方面的应用前景作出了分析与展望。

镰刀菌；ISSR；遗传多样性

镰刀菌属 （Fusarium）是一类世界性分布的真菌，属于兼寄生或腐生真菌。镰刀菌能够在土壤中越冬越夏，并能侵染多种植物，导致植物产生花腐、茎腐、茎基腐、根腐等多种病害，这种致病菌的寄主植物有100多种，能引起黄瓜枯萎病、菠菜枯萎病、豇豆枯萎病、茄子根腐病、辣椒枯萎病及莲藕腐败病等，侵染寄主植物的维管束系统，并产生毒素为害作物，使作物萎蔫死亡，严重影响多种作物的质量和产量，引起严重的经济损失；部分镰刀菌菌株能寄生在昆虫、真菌、线虫上，作为生防菌被利用[1，2]；部分镰刀菌能够产生真菌毒素，人畜食用了含该致病菌的作物之后，会出现食物中毒，严重的甚至死亡；部分镰刀菌菌株能够侵染人和动物，引起严重的疾病，还能够分解纤维素，从而对整个地球生物圈的物质循环起到一定的作用。镰刀菌属对人类影响如此之大，因此近200 a来，许多科学家对镰刀菌属的分类学进行了大量研究[3]。但由于镰刀菌形态变异较大，给镰刀菌的分类造成了一定的困难，使镰刀菌的分类成为了一大难题。镰刀菌分类学研究是镰刀菌生物学各个领域研究的基础，因此对镰刀菌分类学的研究具有重要意义。

1 镰刀菌属遗传多样性研究进展

镰刀菌属是真菌中最难鉴定和最具价值的属之一。自Wollenweber和Reinking于1935年提出该属的分类系统以来，随后在此基础上陆续出现了10余种主要以形态学为依据的分类系统[4]。目前被人们广泛应用的有两大分类系统，其中一个是Burgess等[5]和Nelson等[6]提出的澳大利亚—美国—南非分类系统，另一个是欧洲分类系统[4]。我国最早进行系统的镰刀菌属分类学研究的科学工作者是俞大绂[7]，在30多年时间里，他做了大量的镰刀菌属分类学研究工作，终于在1955年正式发表了《中国镰刀菌属（Fusarium）菌种的初步名录》，为之后学者们的研究工作奠定了基础。1958年，王云章等翻译了《镰刀菌》，推动了我国镰刀菌的研究工作的开展[3]。随后陈鸿逵等[8]采用Booth的分类系统，对镰刀菌进行了11 a的分类研究，发表了《浙江镰刀菌志》。1989年之前，国内外学者开展的镰刀菌分类学研究工作均以形态学为基础，镰刀菌属在形态学上的分类特征主要有厚垣孢子的有无及其产生方式；大、小型分生孢子的形态及其产生方式；产孢细胞的类型；分生孢子以及气生菌丝的着生方式等。由于其分类的一些性状不稳定，给实际鉴定带来许多困难；同时以形态学为基础建立的分类系统也难以准确反映其系统发育关系。

以分子生物学为基础建立的 Phylogenetic species能弥补以形态学为基础的分类系统的一些不足，可科学地反映镰刀菌的系统发育[9~12]。1989年Guadet等[13]首次应用分子生物学方法鉴定镰刀菌属种，随后O'Donnell等[14]也采用了分子生物学方法对镰刀菌属的分类学进行了大量的研究。20多年来，学者们采用分子生物学方法对该属的分类学做了大量研究工作，并澄清了镰刀菌属很多种间、种内系统发育关系、有性型-无性型的联系。当前用于镰刀菌属分类学研究的分子生物学技术主要有RFLP、PAPD和AFLP[15，16]。在真菌分类学应用方面，SSR分子标记技术目前还未得到广泛采用，而RFLP、RAPD、AFLP和SSR等分子标记技术在研究致病菌种DNA遗传物质差异性方面难度均比较大，只有ISSR技术在研究镰刀菌属的种间遗传差异，特别是种内生理小种的分化方面具有优越性[17]。

2 ISSR分子标记技术应用于镰刀菌属遗传多样性分析

ISSR（inter-simple sequence repeat）是Zietkiewicz等[17]在1994年提出的一种微卫星基础上的分子标记。ISSR分子标记技术的基本原理是，以锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的5'或3'端加上2～4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得以区分，然后依据电泳条带的有无以及相对位置来分析不同DNA样本间ISSR分子标记的多态性。与SSR相比，ISSR引物可以在不同物种间通用，不像SSR引物具有较强的特异性。与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，精确度也较高。因此该技术是一种非常有发展前途的分子标记。目前该分子标记技术已经被广泛应用于作物的遗传多样性分析中。

李蕊倩等[18]应用ISSR技术辨别了全部供试的27株镰刀菌，研究发现ISSR分子标记技术能够使镰刀菌种间和种内均表现出很明显的遗传多样性，因此认为ISSR分子标记技术可以用于分析研究镰刀菌种间和种内遗传多样性。其研究还发现采用ISSR技术对27个镰刀菌菌株所分的种类与按传统的形态分类学方法所分的种类基本上是一致的，但是也有一些镰刀菌菌株所分种类与传统的形态学分类方法所分的不一样。他们认为在传统形态分类学上相同的种，其种内的个体之间存在比较大的DNA分子水平上的差异。因此，在传统的形态分类学的基础上，利用DNA分子水平上的遗传学证据建立新的分类系统有待今后进一步研究。王建明等[19]为了确定镰刀菌属美丽组（Section Elegans）中尖孢镰刀菌（F.oxysporum）和芬芳镰刀菌（F.redolens）2种菌的遗传差异性和亲缘关系，利用ISSR分子标记技术对这2种菌的35个菌株进行了遗传多样性分析。他们发现对全部供试的 35个菌株进行ISSR-PCR扩增均可取得很好的效果，说明镰刀菌DNA基因组的SSR区域的遗传差异性明显、多态性高，表明ISSR分子标记技术用于分析镰刀菌种间和种内遗传差异十分有效。

段会军等[20]利用ISSR分子标记技术对50个西瓜枯萎病菌株进行了遗传多样性分析，他们发现ISSR分子标记技术能揭示西瓜枯萎病病菌的遗传背景，并对全部供试的50个菌株进行了ISSR-PCR扩增，均可取得很好的效果，说明ISSR分子标记技术用于分析西瓜枯萎病菌生理小种的遗传差异是可行的。苑琳等[21]利用ISSR分子标记技术对从胡麻枯萎病病株中分离得到的30个菌株进行了遗传多样性分析，在相似系数为0.86处，30个菌株被分为4个群体，此结果表明，虽然全部供试的30个菌株都属于镰刀菌属尖孢镰刀菌种，具有比较高的遗传相似性，但其种内仍然具有一定的遗传多态性，表明ISSR分子标记技术用于分析胡麻枯萎病菌种内的遗传差异是可行的。苑琳等[22]采用ISSR分子标记技术对尖孢镰刀菌胡麻专化型进行了进一步的研究，对收集的96个病株进行了分析研究，发现胡麻枯萎病菌种内存在明显的多态性，同时认为不同来源的尖孢镰刀菌菌株之间，不仅在形态性状方面会呈现一定程度上的差异，而且在分子遗传水平上也会有很明显的差异，其基因在SSR区域上的遗传多态性很复杂而且分化很明显，说明ISSR分子标记技术能够揭示出各菌株DNA分子水平上的遗传多样性，这也表明了ISSR分子标记有很高的灵敏度，能够用于研究尖孢镰刀菌种内菌株之间的遗传多样性。

3 展望

ISSR作为一种新型的分子标记技术，具有简单、经济、快速、多态性高、安全性高、重复性好等优点，现已在遗传多样性分析、植物品种鉴定、基因定位、遗传作图、进化及分子生态学等研究领域中广泛应用[10]。此外，与依据形态学特征进行分类鉴定的分类系统相比，ISSR分子标记能直接检测到DNA分子结构上的变异，反映出研究材料本质上的差异，而且真菌DNA稳定，不容易受到外部环境的影响，在其任何生活阶段都能够提取获得，因此，ISSR技术在镰刀菌属的分类学研究方面具有重要的应用前景和实用价值。ISSR分子标记技术目前已经广泛应用于多种作物中，但在镰刀菌遗传多样性方面的研究还很不足。我们应借鉴ISSR技术在各种作物中成功应用的经验，再结合传统的以形态学为基础的分类系统，积极拓宽ISSR分子标记技术在镰刀菌属分类研究中的应用深度，促使镰刀菌属分类学研究进步和发展。

[1]Summerell B A,Leslie J F,Backhouse D,et al.Fusarium：Paul E.Neison Memorial Symposium[M].Minnesota:The American Phytopathological Society Press,2001:1-360.

[2]Moss M O,Smith J E.The applied mycology ofFusarium[M].Cambridge:Cambridge University Press,1984:1-264.

[3]张向民.镰刀菌属分类学研究历史与现状[J].菌物研究，2005，3（2）：59-62.

[4]Wollenweber H W,Reinking O A.DieFusarien,ihre beschreibung,schadwirkung und bekampfung[M].Berlin: Verlag Paul Parey,1935:355.

[5]Burgess L W,Summerell B A,Bullock S,et al.Laboratory manual forFusariumresearch(3rd)[M].Sydney:University of Sydney,1994:1-133.

[6]Nelson P E,Toussoun T A,Marasas W F O.Fusariumspecies:An illustrated manual for identification[M].University Park and London:The Pennsylvania State University Press,1983:1-193.

[7]俞大绂.中国镰刀菌属（Fusarium）菌种的初步名录[J].植物病理学报，1955（1）：1-17.

[8]陈鸿逵，王拱辰.浙江镰刀菌志[M].杭州：浙江科学技术出版社，1991：1-72.

[9]Leslie J F,Zeller K A,Summerell B A.Icebergs and species in populations ofFusarium[J].Physiological and Molecular Plant Pathology,2001,59(3):107-117.

[10]Tapani Y M,Sari P H,Sergey A B,et al.Molecular,morphological and phylogenetic analysis of theFusarium avenaceum/F.arthrosporioides/F.tricinctumspecies complex-a polyphasic approach[J].Mycological Research,2002,106 (6):655-669.

[11]Pavlina K,Tapani Y M.IGS-RFLP analysis and development of molecular markers for identification ofFusarium poae,Fusarium langsethiae,Fusarium sporotrichioidesandFusarium kyushuense[J].International Journal of Food Microbiology,2004,95(3):321-331.

[12]Visentin I,Tamietti G,Valentino D,et al.The ITS region as a taxonomic discriminator betweenFusarium verticillioidesandFusarium proliferatum[J].Mycological Reseach, 2009,113(10):1 137-1 145.

[13]Guadet J,Julien J,Lafay J F,et al.Phylogeny of someFusariumspecies,as determined by large-subunit rRNA sequence comparison[J].Molecular Biology and Evolution, 1989,6:227-242.

[14]O'Donnell K,Cicugelnik E,Nirenberg H I.Molecular systematics and phylogeography of theGibberella fujikuroispecies complex ofFusarium[J].Mycologia,1998,90: 465-493.

[15]Paavanen-Huhtala S,Hyvonen J,Bulat S A,et al.RAPDPCR,isozyme,rDNA RFLP and rDNA sequence analysis in identification of FinnishFusarium oxysporumisolates[J]. Mycological Research,1999,103(5):625-634.

[16]Zhang B J,Zhang J R,Guo M X,et al.PCR-RFLPs analysis of rDNA ITS ofFusarium(in Chinese)[J].Journal of Agricultural Biotechnology,2007,15(6):545-546.

[17]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20(2): 176-183.

[18]李蕊倩，何瑞，张跃兵，等.镰刀菌ISSR标记体系的建立及遗传多样性分析[J].中国农业科学，2009，42（9）：3 139-3 146.

[19]王建明，李蕊倩，畅引东，等.尖孢镰刀菌及芬芳镰刀菌遗传多样性的ISSR分析[J].植物病理学报，2011，41（4）：337-344.

[20]段会军，张彩英，李喜焕，等.基于RAPD、ISSR和AFLP对西瓜枯萎病菌遗传多样性的评价[J].菌物学报，2008，27（2）：267-276.

[21]苑琳，路福平，刘珊珊，等.河北省胡麻专化型尖孢镰刀菌遗传多样性的ISSR分析[J].CMBB，2010：350-353.

[22]苑琳，刘珊珊，路福平，等.尖孢镰刀菌胡麻专化型（Fusarium oxysporumf.sp.lini）ISSR标记聚类分析[J].中国油料作物学报，2012，34（2）：193-200.

ISSR Analysis on Genetic Diversity ofFusarium

WANG Xianhui1,2,WEI Lin2,LIANG Zhihuai3,CHEN Yurong2,ZHANG Yi1,2
(1.Longping School,Central South University,Changsha 410125;2.Hu'nan Plant Protection Institute; 3.Hu'nan Watermelon and Muskmelon Research Institute)

In this paper,we summarized the progress on studying the genetic diversity ofFusariumby molecular biology methods,and also analyzed the application prospects of ISSR marker on studying the genetic diversity ofFusarium.

Fusarium;ISSR;Genetic diversity

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.16.003

国家公益性行业（农业）科研专项经费项目“水生蔬菜产业技术体系研究与示范”（200903017）

王献慧（1986-），女，在读硕士，主要从事农作物病害生物防治研究，电话：14789761940，E-mail：wangqing.zhi1986@163.com

魏林（1970-），女，通信作者，副研究员，主要从事农作物病害生物防治研究

2012-06-27